楊夢雅, 閆非凡, 閆美超, 王賀, 樸仁哲, 崔宗均, 趙洪顏*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133002； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院， 北京 100191)

我國是農(nóng)業(yè)大國，秸稈年產(chǎn)量11.13億 t，秸稈的綜合利用對于社會可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[1]，尤其在我國北方糧食主產(chǎn)區(qū)，秸稈資源非常豐富，受低溫影響秸稈降解率是一直困擾秸稈還田化和肥料化處理方式的現(xiàn)實問題。秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，由于天然木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，因此如何快速分解木質(zhì)纖維素一直是秸稈資源生物轉(zhuǎn)化和利用的瓶頸。研究證實，單菌的木質(zhì)纖維降解能力要遠遠低于多菌協(xié)同的復(fù)合菌系，因此利用復(fù)合菌系降解木質(zhì)纖維素的研究越來越受到重視[2-4]。目前，分離了多種具有分解秸稈的纖維素分解菌復(fù)合系，但主要集中在高溫和中溫復(fù)合菌系對秸稈降解率方面的研究。崔宗均等[5]在60 ℃下成功構(gòu)建了高效而穩(wěn)定的復(fù)合菌系MC1，培養(yǎng)4 d水稻秸稈的分解率可達60%[6]，培養(yǎng)15 d分解小麥秸稈70%[7]；王偉東等[8]在高溫堆肥材料中篩選得到了復(fù)合菌系WSC-6，培養(yǎng)3 d水稻秸稈的分解率可達82.2%；Eichorst等[9]從高溫堆肥材料中富集得到高溫好氧復(fù)合菌系，分析了復(fù)合菌系的多樣性。王小娟等[10]篩選出菌群WSD-5，在30 ℃下培養(yǎng)15 d小麥秸稈分解率為75.6%；王偉東等[11]篩選出復(fù)合菌系BYND-8，在30 ℃下培養(yǎng)12 d水稻秸稈分解率為64.98%；究其原因是高溫和中溫復(fù)合菌系菌群的多樣性更豐富，可解除產(chǎn)物的反饋抑制，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，提高了菌株之間的協(xié)同作用，從而可提高纖維素的轉(zhuǎn)化率，因此，復(fù)合菌系表現(xiàn)出較強的分解能力。薩如拉等[12]利用繼代培養(yǎng)和低溫馴化的方法，在低溫15 ℃條件下篩選到了2個復(fù)合菌系，玉米秸稈的降解率僅在30%左右。低溫下木質(zhì)纖維素復(fù)合菌系報道相對較少，主要原因是低溫下，復(fù)合菌系菌群多樣性低、穩(wěn)定性較差、降解效率低，因此報道較少。

本研究采用限制性培養(yǎng)馴化手段獲得低溫復(fù)合菌系PLC-8，通過pH、木質(zhì)纖維素含量、玉米秸稈減重、揮發(fā)性有機酸含量、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和高通量測序技術(shù)研究玉米秸稈的分解效果和微生物群落動態(tài)，為東北寒區(qū)秸稈還田和肥料化利用的快速降解提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

低溫木質(zhì)纖維素復(fù)合菌系PLC-8由本實驗室從低溫生態(tài)環(huán)境腐葉土中篩選獲得。

改良察氏培養(yǎng)基：1.0 g·L-1K2HPO4，1.0 g·L-1(NH4)2SO4，1.0 g·L-1NaNO3，0.5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.01 g·L-1FeSO4·7H2O，0.5 g·L-1KCl，pH 7.0～7.5，所用試劑均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

玉米秸稈預(yù)處理方法：將玉米秸稈剪成7 cm的小段，用1.5%的NaOH溶液浸泡24 h后，然后用自來水沖洗秸稈沖洗并浸泡24 h，至pH為7.0左右，105 ℃烘干至恒重后備用。

1.2 培養(yǎng)條件

裝有64 mL改良察氏培養(yǎng)基的100 mL三角瓶內(nèi)，將0.8 g經(jīng)預(yù)處理的玉米秸稈作為碳源，在121 ℃下滅菌15 min后備用。將培養(yǎng)到第40代的PLC-8復(fù)合菌系按照總體積的20%接種到新鮮培養(yǎng)基中，20 ℃下靜置培養(yǎng)。

1.3 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中評價指標測定

1.3.1pH測定 取培養(yǎng)液5 mL，用pH計(SX-620，上海右一儀器有限公司)測定。

1.3.2秸稈重量及半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量測定 將濾紙60 ℃烘干至恒重，記錄濾紙重。將培養(yǎng)液同分解玉米秸稈殘渣用濾紙過濾，過濾玉米秸稈殘渣連同濾紙60 ℃烘干至恒重，去除濾紙重后得到分解玉米秸稈殘渣重。將玉米秸稈粉碎，過1 mm篩，稱取0.5 g，裝入專用濾袋中。用纖維分析儀(ANKOM 200i，美國安卡姆科技公司)測定纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量。具體步驟參考馬旭光等[13]方法。

1.3.3纖維素酶和木聚糖酶活性測定 酶活包括濾紙酶、內(nèi)切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶酶活。以濾紙50 mg、2%羧甲基纖維素鈉、2%微晶纖維素、0.5%的水楊苷、1%的燕麥木聚糖為底物，使用5.59 g·L-1磷酸氫二鉀和0.41 g·L-1磷酸二氫鉀混合配制緩沖液。采用IUPAC推薦的方法測定濾紙酶、內(nèi)切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶酶活，待反應(yīng)結(jié)束后利用紫外可見光分光光度計 (UV-7502PC，上海壘固儀器有限公司)在波長540 nm處測定吸光值[14]。

1.3.4有機酸含量測定 取1.5 mL待測樣品于2 mL的離心管中，12 000 r·min-1離心10 min，取0.75 mL上清液，并與等量的乙腈混勻，12 000 r·min-1離心10 min，離心后取上清液使用有機濾膜(直徑13 mm，孔0.22 μm)進行過濾。利用高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)進行測量，色譜柱采用HITACHI LaChrom C18-AQ(5 μm)，柱溫25 ℃，波長210 nm，流動相由1 mmol·L-1H2SO4和8 mmol·L-1NaSO4混合配制，流速0.2 mL·min-1，進樣量10 μL·次-1，采集時間45 min。采用甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸為標樣，繪制標準曲線，對待測樣品的出峰物進行定性分析。

1.4 16S和26S rRNA PCR-DGGE分析菌群變化

利用北京百泰克生物科技公司淤泥基因組DNA快速提取和真菌基因組DNA提取試劑盒提取每個處理樣品的總DNA，采用細菌通用引物對357F-GC和517R[15]擴增16S rRNA的V3區(qū)[16]，采用真菌特異引物NL1-GC和LS2[17]擴增26S rRNA的D1區(qū)[17]。引物序列如表1所示，由上海生工公司合成。PCR擴增儀器為S1000TM Thermal Cycle， 美國Bio-RAD公司。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

PCR產(chǎn)物用DGGE分析儀 (DCodeTM Universal Mutation Detection System ，美國Bio-Rad公司)進行分析[15,18-19]。從膠上回收條帶，經(jīng)擴增、濃縮后進行堿基序列分析，所用引物和反應(yīng)條件同上。將PCR產(chǎn)物送上海生工測序，基于GenBank數(shù)據(jù)庫對堿基序列進行比對，分析相似性。

1.5 復(fù)合菌系微生物組成的鑒定

PLC-8培養(yǎng)15 d進行采樣，將樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成Miseq高通量測序。對測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、質(zhì)控、去接頭之后獲得優(yōu)化序列，基于優(yōu)化序列將其97%相似性聚類成為OTUs(operational taxonomic units)。對每條序列進行物種分類注釋。統(tǒng)計每個樣品在各分類水平上的構(gòu)成，利用柱狀圖對物種分類信息可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中pH變化

從圖1可以看出，在第5 d時，培養(yǎng)液的pH降到最低，從起始的7.2降至平均6.94，主要是由于復(fù)合菌系分解木質(zhì)纖維素的過程中產(chǎn)生有機酸。之后開始逐漸回升，在5～10 d內(nèi)上升速度較快，隨后pH變化變緩，第30 d時，pH平均達到7.55，原因在于復(fù)合菌系中多種微生物協(xié)同作用，其產(chǎn)物互相利用和中和，形成較為穩(wěn)定的生態(tài)循環(huán)系統(tǒng)。pH整體呈現(xiàn)一個先下降后回升至微堿性的趨勢，表明復(fù)合菌系具有良好的pH調(diào)節(jié)能力。

2.2 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中秸稈重量變化

培養(yǎng)液中玉米秸稈重量的變化趨勢如圖2所示，在0～5 d時，玉米秸稈重量減少速度相對較快，平均降低了17.35%；第5～20 d重量減少的速度減慢；第20～25 d內(nèi)重量減少的速度增加；第25～30 d重量減少的速度開始變緩?？梢钥闯觯趐H降低時，玉米秸稈重量減少速度加快；pH回升時，玉米秸稈減重速度相對較緩。

2.3 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素分解率變化

測定不同時間的培養(yǎng)液中的玉米秸稈中的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素含量，結(jié)果如圖3所示。可以看出，半纖維和纖維素在0～5 d內(nèi)降解速度相對較快，半纖維素下降了35%，纖維素下降了12%，在第30 d時，半纖維降解了57.28%，纖維素降解了40.9%。木質(zhì)素含量在整個過程中的絕對含量下降，在0～5 d，玉米秸稈的重量迅速減少，纖維素和半纖維素較快分解，木質(zhì)素的含量也處于上升階段。

2.4 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中纖維素酶和木聚糖酶活性變化

如圖4所示，復(fù)合菌系分解過程中產(chǎn)生的濾紙酶即總纖維素酶活性在第20 d達到了最高峰0.054 U·mL-1，隨后濾紙酶活性緩慢下降，在第30 d該復(fù)合菌系的濾紙酶活性下降到其最高峰值的87%。復(fù)合菌系分解木質(zhì)纖維素過程中，纖維素內(nèi)切酶和外切酶均在第15 d達到最高峰，分別為0.032和0.030 U·mL-1，到第30 d，分別下降到最高值的93%和92%。β-葡萄糖苷酶在第20 d達到最高峰，為0.032 U·mL-1，到第30 d，下降到最高值的93%。

在復(fù)合菌系分解過程中木聚糖酶活性如圖5所示。隨著木質(zhì)纖維素分解，木聚糖酶卻繼續(xù)增長，可能是由于玉米秸稈半纖維素的主要成分是木聚糖，隨著半纖維素的持續(xù)分解，產(chǎn)酶的活性也隨著增加。

2.5 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中揮發(fā)性有機酸含量變化

對5種揮發(fā)性有機酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸)進行檢測，甲酸和乙酸的濃度發(fā)生變化。從表2可以看出，甲酸的高峰值出現(xiàn)在第20 d，只有0.101 3 g·L-1，此后處于下降趨勢。隨著發(fā)酵的進行，木質(zhì)纖維素降解，在5～10 d，有機甲酸的積累量增加速度相對較快。乙酸的濃度遠大于甲酸，在15 d達到最高值2.423 5 g·L-1，這是由于pH在這個階段增加速度減慢，此后乙酸逐漸減少。乙酸的濃度減少的原因可能與復(fù)合菌系中存在以乙酸為代謝底物的微生物有關(guān)。上述結(jié)果表明，隨著接種復(fù)合菌系發(fā)酵產(chǎn)物中甲酸和乙酸的積累，可能是造成pH開始下降的主要原因。并且這兩種有機酸在發(fā)酵后15～20 d最高。

表2 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中揮發(fā)性有機酸含量變化 Table 2 Changes of volatile organic acids content during the decomposition of corn stover by microbial consortium

2.6 復(fù)合菌系分解玉米秸稈過程中細菌和真菌的變化

在篩選過程中定期對各代的培養(yǎng)基進行保存，提取其DNA利用PCR-DGGE分析菌種的動態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)該復(fù)合菌系從41代開始復(fù)合菌系傳代變化穩(wěn)定。

由圖6可知，在分解過程中培養(yǎng)中的細菌和真菌群落DGGE條帶分析結(jié)果在分解木質(zhì)纖維素過程中，細菌和真菌的主體變化不是很大，其中真菌相對較于細菌而言主體變化更加明顯，可能是因為真菌在該復(fù)合菌系中占較大的作用。其中條帶A、B、C、D、E、a、c、d、e、f、g在所測培養(yǎng)液中均有存在，但是分解過程中的條帶亮度差異明顯，其中條帶C、F和g的亮度較大；條帶b在第25 d有出現(xiàn)，其他時間均未出現(xiàn)。

由圖7、8可知，該復(fù)合菌系中有許多未培養(yǎng)的細菌，其中條帶g與Hypocreales(MH876163.1)有相對較高的相似性。

2.7 復(fù)合菌系細菌與真菌組成多樣性分析

在第15 d時，內(nèi)切酶和外切酶活性達到最高峰，根據(jù)PCR-DGGE結(jié)果(圖6)可以看出，此時菌群相對其他時間變化微弱，在第15 d后，玉米秸稈的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率速度開始變慢，因此對第15 d進行高通量測序。

由表3可知，JY中細菌一共有32 745條有效序列，JY中真菌一共有39 227條有效序列。按97%相似性聚類分析，JY中細菌有82個OTUs，真菌有4個OTUs。

表3 JY中細菌、真菌組成豐度和多樣性指數(shù)Table 3 Richness and diversity index of bacterial, fungus community for JY

樣品JY細菌在門的分類水平上對相對豐度統(tǒng)計結(jié)果為:變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)。由圖9可知，JY樣品中細菌在屬水平上相對豐度高于1%的共有14個，其中相對豐度較高的、占優(yōu)勢的菌屬為金黃桿菌屬(Chryseobacterium，16.27%)；短波單胞菌屬(Brevundimonas，14.56%)；不動桿菌屬(Acinetobacter，13.11%)；無色桿菌屬(Achromobacter，9.24%)；鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium，8.62%)；固氮螺菌屬(Azospirillum，7.44%)；副球菌屬(Paracoccus，6.38%)。細菌群落的多樣性在分解木質(zhì)纖維素中起著重要的作用，有助于維持生物降解過程中的穩(wěn)定性。

樣品JY真菌在門的分類水平上對相對豐度統(tǒng)計結(jié)果為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、Cryptomonadales。JY樣品在真菌組成在屬的水平上包含4個屬的真菌，JY中相對量較高的占優(yōu)勢菌屬為肉座菌(Hypocreales，95.63%)、毛孢子菌屬(Cutaneotrichosporon，3.97%)。

3 討論

目前,對于低溫下分解木質(zhì)纖維素的研究相對較少，而我國東北地區(qū)冬季漫長，同時玉米秸稈資源量大，尤其吉林省占全國玉米秸稈10%以上[20]，基于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實際在低溫區(qū)玉米秸稈的還田化和肥料化利用可以發(fā)揮秸稈的營養(yǎng)元素回歸土地，提供土壤的有機質(zhì)，但是玉米秸稈的降解率一直是難點。低溫下復(fù)合菌系的開發(fā)可以充分提高秸稈的降解率，本研究篩選的PLC-8在20 ℃下培養(yǎng)30 d，玉米秸稈的降解率達到43.65%，比前人研究的高溫、中溫菌的降解率相對較低，但是該低溫復(fù)合菌系能夠?qū)崿F(xiàn)低溫區(qū)玉米秸稈快速降解回饋農(nóng)田的目標，尤其是低溫復(fù)合菌系與高溫、中溫相比較具有一定的區(qū)域應(yīng)用優(yōu)勢性。

該復(fù)合菌系實現(xiàn)可限制性人工長期馴化功能較強、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的菌群，抵御外界的干擾能力比純培養(yǎng)微生物強等優(yōu)勢。此外，PLC-8是細菌和真菌共同存在復(fù)合菌系，大多數(shù)報道的中高溫復(fù)合菌系是由細菌組成[5,8,11]，有很少數(shù)中溫復(fù)合菌系是由細菌和真菌組成[21]，細菌和真菌共存增加了菌群之間代謝產(chǎn)物的協(xié)同作用，因此在低溫下具有較強木質(zhì)纖維分解效果。有學(xué)者從長白山土壤中分離出耐低溫纖維素酶高產(chǎn)真菌菌株，但是單一菌株產(chǎn)酶單一[22]，PLC-8同時產(chǎn)生濾紙酶、內(nèi)切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶以及木聚糖酶，這與復(fù)合菌系PLC-8中存在真菌和細菌有很大的關(guān)系，至于它們之間的代謝關(guān)系如何，需要更近一步的研究。

利用低溫菌劑降解秸稈進行還田，能夠加快秸稈的腐熟、增加土壤微生物數(shù)量、提高農(nóng)作物產(chǎn)量。趙偉等[23]研究了低溫菌劑降解東北黑土區(qū)秸稈還田，發(fā)現(xiàn)使用菌劑能增加土地微生物多樣性及碳、氮含量，且施用低溫菌劑的處理在提高土壤微生物方面優(yōu)于常溫菌劑。常洪艷等[24]通過模擬秸稈還田的培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)施用低溫菌劑可以明顯提高玉米秸稈降解率、改善土壤的理化性質(zhì)和酶活性；利用低溫菌劑堆肥化處理秸稈，張書敏等[25]利用低溫復(fù)合菌系接入到玉米秸稈和牛糞混合堆肥中，發(fā)現(xiàn)低溫復(fù)合菌系能夠使堆肥升溫速度加快，縮短堆肥周期，加快堆肥腐熟。陸水鳳等[26]在玉米秸稈簡易堆肥中添加低溫菌劑，發(fā)現(xiàn)添加菌劑可以縮短腐熟時間，增加了腐熟的效果。所以本研究的低溫降解玉米秸稈復(fù)合菌系為寒區(qū)秸稈還田化和堆肥化利用快速分解菌劑提供保障。