黃偉偉, 畢生雷, 楊迪, 劉雨, 辛納慧, 李鈺媛, 張乃群*

(1.南陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 河南 南陽 473061; 2.河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司, 車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 南陽 473003; 3.南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院, 河南 南陽 473000)

異養(yǎng)小球藻(heterotrophic Chlorella)生長速度是自養(yǎng)藻的40倍,生物量是自養(yǎng)藻的60倍，而且含油量高、占地面積小、可利用工業(yè)發(fā)酵裝置進(jìn)行集約化生產(chǎn)，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物柴油的良好原料[1]。微藻收集成本較高，一般占微藻生物柴油總生產(chǎn)成本的三分之一[2]。目前，藻類收集方法研究較多的是大型藻類、自養(yǎng)微藻類。規(guī)模化收集微藻主要使用工藝和設(shè)備均較成熟的離心法，但該方法能耗大、成本高[3]。目前，異養(yǎng)微藻細(xì)胞采收更多參考了生物發(fā)酵常用的細(xì)胞采收方法。

生物發(fā)酵中常用的細(xì)胞采收方法較多，包括自然沉降法、過濾法、離心法、磁選法、氣浮法、微生物共生法、絮凝法等。自然沉降法是一種設(shè)備簡單、操作成本低廉的采收方法，在發(fā)酵罐或其他輔助儲罐中即可完成，但采收率僅30%[4]。由于異養(yǎng)小球藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量普遍高于50%，藻細(xì)胞密度小，不易沉降，通常需要1 d甚至數(shù)天才能完成，且采收效率過低。過濾法包括板框過濾和膜過濾，采收率均可達(dá)95%以上[5]，其中板框過濾是比較傳統(tǒng)的采收方法，但需要添加大量助濾劑，而且藻細(xì)胞與助濾劑分離困難，不利于后期藻細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)提取和利用；金屬膜過濾是新興的采收方法，但設(shè)備投資成本高，而且膜清洗需要使用大量酸堿，從而造成較大的環(huán)保壓力。離心法是常規(guī)的固液分離方法，采收率可達(dá)99%[6]，一般認(rèn)為離心法能夠完全將藻細(xì)胞分離，但離心法能耗極大。磁選法和氣浮法是近年來出現(xiàn)的新型采收方法，目前技術(shù)并不成熟，普遍存在操作過程要求苛刻、采收成本較高的問題。微生物共生法采收率僅44.78%[7],采收效率低、采收周期長達(dá)數(shù)天。而絮凝法不僅設(shè)備投資成本低、操作成本低，而且采收效率相對較高，可達(dá)90%[4]，通過篩選絮凝劑、優(yōu)化絮凝工藝，完全有可能達(dá)到過濾法、離心法的采收效果。

絮凝法的作用機(jī)理是釋放帶電官能團(tuán)吸附膠體、細(xì)胞，從而使細(xì)胞橋架成大團(tuán)并沉降，可見絮凝劑實(shí)現(xiàn)絮凝效果的前提是能夠與細(xì)胞接觸、細(xì)胞之間橋架成團(tuán)。如果絮凝劑添加量較少，絮凝劑不足以吸附全部膠體、細(xì)胞，那么就不能聚集成團(tuán)并沉積；而如果絮凝劑添加量過多，每個細(xì)胞都被數(shù)個絮凝劑基團(tuán)吸附、包裹，沒有空間去橋架了，細(xì)胞之間可能就無法實(shí)現(xiàn)橋架、無法絮凝成團(tuán)沉降[8]。絮凝法在收集細(xì)胞的同時，對細(xì)胞傷害極小，絮凝團(tuán)內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)完好，游離細(xì)胞可保持良好的活性[9]，對后序提取工藝沒有不良影響。研究表明，絮凝法能夠使自養(yǎng)微藻收集成本降低68.8%[10]。按照所用絮凝劑的不同，絮凝法大致可以分為無機(jī)絮凝法、有機(jī)絮凝法、生物絮凝法。薛蓉等[11]研究表明，殼聚糖、瓊脂等有機(jī)絮凝劑對自養(yǎng)小球藻沒有任何絮凝作用，無機(jī)絮凝劑絮凝效果均比較理想；趙奎等[12]研究了8種絮凝劑對自養(yǎng)小球藻的影響，結(jié)果表明，氫氧化鈣是最理想的絮凝劑，自養(yǎng)小球藻采收率可達(dá)97%。異養(yǎng)小球藻的藻細(xì)胞油脂含量高達(dá)50%以上，但藻蛋白含量僅15%左右。與自養(yǎng)小球藻相比，異養(yǎng)小球藻生物量較高、發(fā)酵液成分復(fù)雜，不僅含有培養(yǎng)基中殘留的葡萄糖、酵母粉、營養(yǎng)鹽等物質(zhì)，還有大量的細(xì)胞碎片、膠體、代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，這些物質(zhì)都是自養(yǎng)小球藻培養(yǎng)液沒有的[13]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)僅涉及異養(yǎng)小球藻的生物絮凝，其他絮凝方法尚未報道。因此，直接借鑒前人的研究可能無法獲得理想結(jié)果。本研究在綜合比較三氯化鐵、硫酸鋁絮凝法、殼聚糖絮凝法、聚丙烯酰胺絮凝法和霉菌吸附法的絮凝效果基礎(chǔ)上，以采收率作為考察指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期探索出適合異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液的絮凝方法，為規(guī)?；瘧?yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

異養(yǎng)小球藻藻種由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液由河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液由異養(yǎng)小球藻使用葡萄糖、酵母粉等原料發(fā)酵所得，發(fā)酵終了生物量為121 g·L-1、pH為6.3，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)100 ℃滅菌、降溫備用。三氯化鐵、硫酸鋁、殼聚糖、聚丙烯酰胺均為市售。黑曲霉(Aspergillusniger3.3928 ) 由河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

ME1002E型電子天平購自梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司，WH220-HT數(shù)字式加熱磁力攪拌器購自伊孚森生物技術(shù)(中國)有限公司，F(xiàn)E28-Bio型pH計購自于梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司，XSP-9CA型顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1絮凝劑的選擇 無機(jī)絮凝法：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入0.5 g·L-1的三氯化鐵、硫酸鋁，在磁力攪拌器上以150 r·min-1的速率攪拌2 min后，靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細(xì)胞數(shù)[12]，并計算采收率。

有機(jī)絮凝法：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入0.5 g·L-1的殼聚糖、聚丙烯酰胺，在磁力攪拌器上以150 r·min-1的速率攪拌2 min后，靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細(xì)胞數(shù)，并計算采收率。

生物絮凝法：采用畢生雷等[7]的方法，在搖瓶發(fā)酵液中補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，并接入黑曲霉繼續(xù)培養(yǎng)，直到霉菌吸附球不再增加為止，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細(xì)胞數(shù)，并計算采收率。

1.2.2絮凝條件優(yōu)化 影響絮凝的參數(shù)有絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間、沉降時間、pH等。對于沉降時間，絮凝后沉降一般在10 min內(nèi)即可完成[14]，絮凝時間對采收率影響并不大；而調(diào)節(jié)pH將會使用額外的酸和堿，采收率較高的pH區(qū)間也往往處于中性范圍[8]。因此，本研究著重考察絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間對采收率的影響。

①絮凝劑添加量對采收率的影響：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L-1的絮凝劑，在磁力攪拌器上以150 r·min-1的速率攪拌2 min后，靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細(xì)胞數(shù)，并計算采收率。

②攪拌速率對采收率的影響：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入2.0 g·L-1的絮凝劑，在磁力攪拌器上以0、50、100、150、200 r·min-1的速率攪拌2 min后，靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細(xì)胞數(shù)，并計算采收率。

③攪拌時間對采收率的影響：取1 000 mL發(fā)酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入2.0 g·L-1的絮凝劑，在磁力攪拌器上以150 r·min-1的速率分別攪拌0、10、20、40、80 min后，靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細(xì)胞數(shù)，并計算采收率。

1.2.3響應(yīng)面分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的主要影響因素，利用Design expert 8.0軟件對絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間3個變量進(jìn)行Box-Behnken-設(shè)計(表1)，然后利用響應(yīng)面分析方法對結(jié)果進(jìn)行回歸模擬，確定最優(yōu)絮凝條件。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 7.5軟件繪圖并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Design expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝劑的選擇

圖1顯示了不同絮凝劑對異養(yǎng)小球藻的采收效果。從圖1可知，三氯化鐵、硫酸鋁等無機(jī)絮凝法采收率普遍高于80%，其中，三氯化鐵采收率最高。而殼聚糖、聚丙烯酰胺等有機(jī)絮凝法和霉菌吸附法采收率普遍低于40%。霉菌吸附效果一般，采收率僅為36.18%，原因可能是異養(yǎng)小球藻發(fā)酵時間長、發(fā)酵液中成分復(fù)雜，霉菌生長狀況不太理想，異養(yǎng)小球藻細(xì)胞較小，霉菌絲無法形成致密的菌絲團(tuán)包裹細(xì)胞。從表2可以看出，由于培養(yǎng)黑曲霉需要補(bǔ)充大量營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致霉菌法收集成本較高。而三氯化鐵綜合成本不足0.1元·kg-1。因此，經(jīng)綜合比較采收率和采收成本，本研究選用三氯化鐵作為進(jìn)一步的研究對象。

表2 不同絮凝劑的成本比較Table 2 Cost comparison of different flocculant

2.2 工藝參數(shù)對采收率的影響

2.2.1絮凝劑添加量對采收率的影響 圖2顯示了絮凝劑添加量對采收率的影響。從圖中可以看出，隨著絮凝劑添加量的增加，采收率不斷提高。當(dāng)絮凝劑添加量達(dá)到2 g·L-1時，采收率達(dá)到92.05%，但繼續(xù)增加用量，采收率并沒有明顯提高。因此，本研究選擇絮凝劑添加量為2 g·L-1。

2.2.2攪拌速率對采收率的影響 從圖3可以看出，隨著攪拌速率的提高，采收率快速增加，說明攪拌使絮凝劑、發(fā)酵液在容器中分布均勻、充分接觸，從而在攪拌速率提高時采收率也得到相應(yīng)提升。但攪拌速率超過150 r·min-1后，采收率反而有所下降。因此，本研究選擇攪拌速率為150 r·min-1。

2.2.3攪拌時間對采收率的影響 圖4顯示了攪拌時間對采收率的影響。從圖中可以看出，隨著攪拌時間的延長，采收率快速提高。當(dāng)攪拌時間達(dá)到20 min時，采收率達(dá)到94.6%，繼續(xù)增加攪拌時間，采收率反而有所降低。因此，本研究選擇攪拌時間為20 min。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面模型的建立 以采收率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，測定結(jié)果見表3。利用軟件建立回歸模型，并選擇最優(yōu)變量。通過軟件分析，進(jìn)行二次多項式擬合，獲得回歸方程：采收率=93.1+1.40A+ 6.49B+0.44C-0.45AB-0.10AC-0.53BC-0.66A2-4.29B2-2.73C2?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2為96.81%，校正后的R2為92.70%，說明試驗(yàn)可靠度高。而變異系數(shù)CV為0.96%，說明試驗(yàn)穩(wěn)定性強(qiáng)，試驗(yàn)操作可信?？傊摶貧w方程為絮凝法收集異養(yǎng)小球藻提供了一個良好的模型。

表3 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 3 Results of response surface analysis

2.3.2響應(yīng)面圖及分析 根據(jù)二次回歸方程，得到各因素交互作用對采收率的響應(yīng)面圖(圖5)。響應(yīng)面圖包含響應(yīng)面和等高線，通過等高線的密集程度及形狀可以觀察出交互作用的強(qiáng)弱，通過響應(yīng)面的升降軌跡則可以觀察出各因素值變動對采收率值的影響。從圖5可知，因素A和因素B的交互作用、因素B和因素C的交互作用相當(dāng)，而因素A和C的交互作用比因素A和B、因素B和C略微顯著。從圖5中還可以看出，隨著因素A、因素B、因素C值的增加，采收率均呈現(xiàn)出先升高后又降低的趨勢。

2.4 回歸模型方差分析結(jié)果

從表4可知，絮凝劑添加量、攪拌時間對采收率影響均不顯著，絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間各變量之間的交互作用不太明顯。二項式模型選擇的最優(yōu)變量為絮凝劑添加量2.0 g·L-1、攪拌速率為150 r·min-1、攪拌時間20 min，此時理論采收率達(dá)到95.3%，與單因素試驗(yàn)結(jié)果保持一致，說明通過響應(yīng)面分析獲得的絮凝法收集工藝條件是可行的。在該采收率情況下重新測算三氯化鐵絮凝法收集成本為0.07元·kg-1，具有實(shí)際應(yīng)用價值，絮凝后異養(yǎng)小球藻在燒杯底部沉積明顯，收集效果較好。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Results of regression model variance analysis

3 討論

3.1 不同絮凝劑對采收率和采收成本的影響

與霉菌吸附相比，聚丙烯酰胺和殼聚糖的絮凝效果更差，采收效果不好。這與鄒婷婷[15]的研究結(jié)果一致，可能是聚丙烯酰胺等絮凝劑更適應(yīng)于污水中有機(jī)物和懸浮物的去除[16]。硫酸鋁、三氯化鐵的采收率較高，但低于薛蓉[17]的研究結(jié)果。原因可能是異養(yǎng)小球藻經(jīng)過十幾天的發(fā)酵，異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液質(zhì)量體積濃度高達(dá)121 g·L-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自養(yǎng)小球藻的2 g·L-1，這導(dǎo)致溶液黏度過大、不利于高分子鏈的分散，導(dǎo)致絮凝效果較差[18-20]。發(fā)酵液中不僅有大量的代謝產(chǎn)物，還存在膠體、細(xì)胞碎片等物質(zhì)，干擾了無機(jī)離子的電中和作用。與其他采收方法相比，三氯化鐵采收率相對較高，且采收成本相對較低，適合開展進(jìn)一步的工藝優(yōu)化，以進(jìn)一步提高采收率。

3.2 不同工藝參數(shù)對采收率的影響

本研究選擇絮凝劑添加量為2 g·L-1。而趙奎等[12]研究表明，絮凝劑用量越大越好，與本研究結(jié)果有差異，可能是該研究所用研究對象是自養(yǎng)藻，培養(yǎng)液中成分簡單，只有水、少量可溶性無機(jī)鹽和藻細(xì)胞。另外，該研究的試驗(yàn)過程中采收率并沒有達(dá)到最大值，采收率始終隨著絮凝劑的用量而增加。

攪拌是生化反應(yīng)中的常用操作，目的是為了使溶液中的各種成分能夠混合均勻，以防局部反應(yīng)物濃度過高，從而縮短反應(yīng)時間，提高反應(yīng)速率。絮凝劑、發(fā)酵液均是可溶性物質(zhì)，絮凝劑通過橋架、吸附等作用，同時還發(fā)生一些物理化學(xué)變化，進(jìn)而膠體等微粒相互碰撞、相吸形成絮狀沉淀。但攪拌在提高絮凝劑、發(fā)酵液混合均勻度的同時，也會影響絮狀沉淀，攪拌速率過大會導(dǎo)致絮凝效果變差。本研究中攪拌速率超過150 r·min-1后，采收率反而有所下降，這可能是由于攪拌速率過高，產(chǎn)生的剪切力過大，這種作用力超過了絮凝劑與細(xì)胞之間的橋架、吸附作用力，從而將部分絮凝團(tuán)打散、采收率下降。本研究相關(guān)結(jié)果與陳曉燕等[14]的研究結(jié)果相同。

絮凝是一個緩慢的過程，不像酸堿中和之類的生化反應(yīng)那樣劇烈，因此，絮凝過程需要一定的時間。攪拌能夠讓反應(yīng)體系中各成分混合均勻、充分接觸，如果攪拌時間過短，就會導(dǎo)致絮凝不完全，采收率不理想。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)攪拌時間達(dá)到20 min時，采收率達(dá)到94.6%，繼續(xù)延長攪拌時間，采收率反而有所降低。這說明，在合適的剪切力范圍內(nèi)，隨著絮凝的完成，絮凝團(tuán)內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。陳曉燕等[14]研究表明，使用陽離子淀粉絮凝劑收獲自養(yǎng)斜生柵藻，攪拌10 min即可達(dá)到最高采收率，繼續(xù)攪拌將浪費(fèi)能源。本研究所用攪拌時間較長的原因是生物量高、發(fā)酵液成分極其復(fù)雜。

由于發(fā)酵液成分復(fù)雜、雜質(zhì)過多，有機(jī)絮凝劑、霉菌吸附均對異養(yǎng)小球藻絮凝效果不太理想，無機(jī)絮凝劑三氯化鐵顯示了較好的絮凝效果。通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面分析，獲得了最優(yōu)變量為絮凝劑添加量2.0 g·L-1、攪拌速率150 r·min-1、攪拌時間20 min，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證可得采收率達(dá)到95.3%，回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)均表明響應(yīng)面分析結(jié)果合理、可信。

本研究獲得的最佳工藝條件下采收率仍然比自養(yǎng)藻的絮凝法低，自養(yǎng)藻的生長僅需要光照、二氧化碳，自養(yǎng)藻工業(yè)化培養(yǎng)過程為了提高培養(yǎng)效率往往在培養(yǎng)液中加入少量無機(jī)鹽，張正潔等[21]在培養(yǎng)自養(yǎng)藻時僅加入0.02 g·L-1的碳酸鈉，異養(yǎng)藻在培養(yǎng)過程中使用大量的營養(yǎng)成分，從生物量角度分析，自養(yǎng)藻生物量受到光照、營養(yǎng)物質(zhì)限制，一般生物量僅2 g·L-1，而異養(yǎng)藻則高達(dá)140 g·L-1。因此，整體而言，自養(yǎng)藻培養(yǎng)液生物量、營養(yǎng)鹽濃度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于異養(yǎng)藻，培養(yǎng)液成分復(fù)雜導(dǎo)致異養(yǎng)藻絮凝過程受到干擾，采收率低于自養(yǎng)藻。這也是絮凝法在異養(yǎng)小球藻實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用相對較少的原因之一。與前人研究結(jié)果相比，本研究的絮凝劑用量偏高，可能是藻液特性的影響，也可能是試驗(yàn)手段較為單一。本研究將在后續(xù)試驗(yàn)中借鑒其他試驗(yàn)手段對試驗(yàn)方法進(jìn)一步優(yōu)化[22]。傳統(tǒng)細(xì)胞采收使用的絮凝法采收率往往接近于100%[23]，而本研究所獲得的結(jié)果相對較低，這也說明單一絮凝劑使用效果有一定的局限性。彭超等[24]的研究表明，選擇合適的復(fù)合絮凝劑將產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，使采收率遠(yuǎn)高于單一絮凝劑，絮凝效果更好；任翱等[25]使用絮凝法與加壓相結(jié)合進(jìn)行絮凝采收，也取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。因此，本研究將在后續(xù)試驗(yàn)中開展進(jìn)一步的研究。