陳曦，李英英，陳強(qiáng)，宋鐵英，葛均青

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

福建省是鰻鱺Anguillidsp.養(yǎng)殖大省，鰻鱺產(chǎn)值在該省水產(chǎn)品貿(mào)易中占重要地位，因此，對鰻鱺疫病的研究尤為重要。鰻鱺疫病的病原有病毒性、細(xì)菌性、寄生蟲等，目前對其病毒性疾病缺乏有效防控措施。該類疾病暴發(fā)時，常呈現(xiàn)出大范圍的區(qū)域傳播態(tài)勢，給養(yǎng)殖行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]?！懊擆⊙C合征”是養(yǎng)殖鰻鱺白仔、黑仔階段普遍發(fā)生的一種傳染性疫病，自20世紀(jì)90年代就普遍發(fā)生。本試驗(yàn)在前期研究中，利用鰻鱺卵巢細(xì)胞系(Eel ovary, EO)從病料中分離出鰻鱺皰疹病毒(Anguillid herpesvirus，AngHV)，流行病學(xué)致病性分析表明，AngHV就是鰻鱺“脫黏敗血綜合征”的致病病原[2]。

AngHV為線性雙鏈DNA病毒，隸屬于魚蛙皰疹病毒亞科Alloherpesviridae鯉皰疹病毒屬Cyprinivirus[3]。目前，鯉皰疹病毒屬中研究較多的包括對鯉科魚類危害較大的鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)和鯉皰疹病毒Ⅲ型(cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)等病毒，并已開展了病原學(xué)、流行病學(xué)、感染機(jī)制、診斷及防控等方面的研究[4-5]，但基因功能方面的研究較少?；蛐蛄蟹治霰砻?，AngHV與CyHV-3的遺傳距離最近，有40個同源基因，但序列的一致性均較低，僅為19%～58%。因此，有必要對AngHV基因開展深入研究。

AngHV基因組全長248.5 kbp，由一段長序列及兩側(cè)11 kbp末端重復(fù)序列組成，具136個開放閱讀框(ORF)[6-7]。其病毒粒子由核衣殼、間質(zhì)層和囊膜組成，預(yù)測含有7個衣殼蛋白、11個囊膜蛋白和22個被膜蛋白[8]。囊膜蛋白作為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒入侵宿主細(xì)胞、胞間傳遞、組織嗜好性及宿主范圍等方面密切相關(guān)[9-12]，也常常被用來開發(fā)基因工程疫苗[13-14]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，ORF8是AngHV的結(jié)構(gòu)蛋白，并大量存在于病毒粒子的囊膜中[8]。對病毒基因表達(dá)時序的研究，有助于了解病毒復(fù)制周期、基因功能、病毒與宿主的相互作用及疾病控制[15]。目前，國內(nèi)外尚未見對鰻鱺皰疹病毒ORF8基因及蛋白特征研究的報(bào)道。本研究中，通過設(shè)計(jì)引物，從AngHV-FJ病毒株中克隆ORF8基因，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明其符合囊膜蛋白的基本特征；采用RT-PCR方法分析該基因在病毒入侵細(xì)胞過程中的轉(zhuǎn)錄時相，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了ORF8在大腸桿菌中的高效表達(dá)，獲得了高純度的融合表達(dá)蛋白，以期為免疫診斷試劑和疫苗研究提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

AngHV福建株(AngHV-FJ) 由福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所分離，EO 細(xì)胞、表達(dá)載體pET-32a、克隆菌株EscherichiacoliDH5α、表達(dá)宿主菌E.coliBL21 (DE3)均由福建省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 AngHV-FJ的細(xì)胞擴(kuò)繁及基因組DNA的提取 EO 細(xì)胞用L-15細(xì)胞培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(美國Hyclone生物公司))于26 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋪滿單層的EO細(xì)胞按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為1.0的比例接種AngHV-FJ病毒，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時，利用Pure LinkTMViral RNA/DNA Mini Kit(美國英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen))提取基因組DNA，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AngHV-FJORF8基因的克隆 以AngHV標(biāo)準(zhǔn)株的基因組(NC_013668)為參考，設(shè)計(jì)ORF8基因的特異性引物，分別在上下游加入BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa))。引物序列：ORF8-F為ggatccATGTATAAGGCGTTGAGC，ORF8-R為gaattcTTACGCCCTGGCGTTGGT。以提取的AngHV-FJ基因組DNA為模板，進(jìn)行ORF8基因序列的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，利用DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)純化，并與pMD19-T載體(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa))連接，利用質(zhì)粒小量抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后，陽性克隆測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)驗(yàn)證，獲得質(zhì)粒T-ORF8。

1.2.3 AngHV-FJORF8 基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的Blast在線工具對擴(kuò)增獲得序列進(jìn)行比對分析，利用Softberry進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄啟動子分析；利用ExPASy的Protparam預(yù)測蛋白理化性質(zhì)，利用CDD工具分析編碼蛋白保守功能域，利用TMHMM分析跨膜結(jié)構(gòu)域，利用SignalP-4.1預(yù)測蛋白的信號肽，利用Psort預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位，利用BepiPred對蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測。

1.2.4 AngHV-FJORF8基因的表達(dá)時序分析 EO細(xì)胞按照MOI為1.0的比例接種AngHV-FJ病毒，在接種病毒后的0、3、6、24、48、72、96、120 h收集細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)DNase消化后，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa))合成cDNA，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增內(nèi)參基因ACTB和ORF8的引物序列：ACTB-F為TCCAGGCCGACGTAGCACAG，ACTB-R為TGGCCCCCGAGGAGCAC；ORF8-F為ATGTATAAGGCGTTGAGC，ORF8-R為TTACGCCCTGGCGTTGGT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.2.5 表達(dá)質(zhì)粒32a-ORF8的構(gòu)建 分別將質(zhì)粒T-ORF8和pET-32a用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，獲得的片段利用DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)純化，利用T4 DNA連接酶(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa))連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切確認(rèn)，獲得質(zhì)粒32a-ORF8。

1.2.6 質(zhì)粒32a-ORF8的誘導(dǎo)表達(dá) 將質(zhì)粒32a-ORF8轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliBL21( DE3)細(xì)胞中，挑選平板上陽性克隆，于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)過夜，次日接種于新鮮LB中，培養(yǎng)至吸光度OD600 nm為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L， 37 ℃下再培養(yǎng)12 h，離心收集細(xì)菌菌體，超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 融合蛋白的Western blot鑒定 上述樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜放入含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液中37 ℃下封閉1 h， 用TBST 緩沖液洗膜后，與1∶5 000倍稀釋于TBS中的鼠抗 His-Tag單克隆抗體(英國艾博抗生物技術(shù)有限公司(Abcam))在室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗膜后，與1∶15 000倍稀釋于TBST緩沖液中的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國Cell Signaling Technology (CST)) 室溫孵育1.5 h，用TBST洗膜后，采用Super ECL Plus化學(xué)發(fā)光液(北京蘭博利德商貿(mào)有限公司(LabLead))顯色，用ChemiScope 6000 Touch成像系統(tǒng)拍照(上海勤翔生物科技有限公司)。

1.2.8 融合表達(dá)蛋白的純化 收集表達(dá)菌，超聲破碎后進(jìn)行蛋白的SDS-PAGE分離,染色后，將含目的條帶的凝膠切下，在研缽(-80 ℃預(yù)冷)中研磨后，利用PAGE-膠蛋白微量回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收蛋白，置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 AngHV-FJ ORF8基因的克隆

利用設(shè)計(jì)的引物對ORF8-F/ORF8-R，從AngHV-FJ基因組中擴(kuò)增出約650 bp的特異性條帶(圖1(a))，連接至pMD19-T載體，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定(圖1(b))，經(jīng)測序驗(yàn)證，確定克隆的就是AngHV-FJ的ORF8序列，將質(zhì)粒命名為T-ORF8。

M1—DL2000 DNA Marker;M2—DL5000 DNA Marker;1—ORF8;2—陰性對照;3—BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切。M1—DL2000 DNA Marker； M2—DL5000 DNA Marker；1—ORF8；2—negative control; 3—double enzyme digestion by BamHⅠ/EcoRⅠ.圖1 AngHV-FJ ORF8基因的PCR擴(kuò)增及克隆Fig.1 PCR amplification and cloning of AngHV-FJ ORF8

2.2 AngHV-FJ ORF8基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 AngHV-FJORF8 基因序列分析 Blast分析表明，AngHV-FJORF8的基因序列與GenBank中參考株AngHV-1的 (NC_013668)ORF8序列一致性為99.84%，僅在基因的第544 bp堿基處出現(xiàn)點(diǎn)突變(T→C)，對應(yīng)基因編碼的氨基酸由Y→H。Softberry的基因轉(zhuǎn)錄啟動子分析顯示，在上游-10 bp和-35 bp處分別存在為TATAAG和TTGTCT的啟動子序列，在-20 bp處存在轉(zhuǎn)錄因子rpoD15的潛在結(jié)合位點(diǎn)，序列為TTTTGTTT；在終止密碼子TAA下游41 bp處存在poly A尾，序列為AATAAAAA。

2.2.2 AngHV-FJ ORF8蛋白特征分析 Protparam分析顯示，預(yù)測ORF8基因編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為23 700,等電點(diǎn)為5.72，屬于酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為19.65，比較穩(wěn)定；總平均親水性為-0.206，為親水性蛋白。CDD、TMHMM、SignalP-4.1、Psort和BepiPred分析顯示，ORF8蛋白不含保守功能區(qū)，在氨基酸序列的第158～180位存在跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜，并存在10個潛在抗原位點(diǎn)，表明ORF8蛋白可能具有較好的免疫原性(表1)。

表1 AngHV-FJ ORF8蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

2.3 AngHV-FJ ORF8基因的轉(zhuǎn)錄時相分析

AngHV感染EO細(xì)胞后120 h，多數(shù)細(xì)胞發(fā)生CPE。為了解AngHV入侵細(xì)胞后ORF8的表達(dá)情況，本試驗(yàn)中在EO細(xì)胞感染AngHV-FJ后的不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞，利用RT-PCR方法對ORF8的轉(zhuǎn)錄時相進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，ORF8在病毒感染細(xì)胞后3 h就可以檢出，在24 h達(dá)到高峰，隨后表達(dá)量無明顯變化，作為對照的內(nèi)參基因ACTB在所有時間點(diǎn)的表達(dá)量無顯著性差異(圖2)。這表明，ORF8基因可能是AngHV的早期基因，在病毒感染早期發(fā)揮作用。

2.4 AngHV-FJ ORF8基因在大腸桿菌中的表達(dá)

質(zhì)粒T-ORF8用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，回收目的片段，與表達(dá)載體pET-32a連接，連接質(zhì)粒用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果出現(xiàn)大小約650 bp的特異性條帶(圖3)，這表明成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒32a-ORF8。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，與未經(jīng)誘導(dǎo)的全菌蛋白相比，含pET-32a載體的誘導(dǎo)菌在相對分子質(zhì)量為20 400處有明顯的蛋白條帶，而含32a-ORF8的誘導(dǎo)菌在約44 000處有明顯的蛋白條帶(圖4(a))。

M—DL1000 Marker； NA—陰性對照。M—DL1000 Marker； NA—negative control.圖2 AngHV感染EO細(xì)胞后ORF8轉(zhuǎn)錄時相的RT-PCR分析Fig.2 ORF8 transcription profiles in AngHV infected EO cells by RT-PCR analysis

M—DL5000 DNA Marker； 1 —BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切。M—DL5000 DNA Marker； 1—double enzyme digestion by BamHⅠ/EcoRⅠ.圖3 質(zhì)粒32a-ORF8酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion of the plasmid 32a-ORF8

進(jìn)一步的Western blot分析表明，與未經(jīng)誘導(dǎo)的全菌蛋白相比，含pET-32a載體的誘導(dǎo)菌可被鼠抗His-Tag單克隆抗體檢測到相對分子質(zhì)量為20 400的蛋白條帶，而含32a-ORF8的誘導(dǎo)菌可被鼠抗His-Tag單克隆抗體檢測到相對分子質(zhì)量約44 000的蛋白條帶(圖4(b))，表明表達(dá)的ORF8蛋白與預(yù)期23 700的大小一致，實(shí)現(xiàn)了ORF8基因在E.coliBL21(DE3)中的完全表達(dá)。

M—預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker；1—BL21全菌蛋白；2—未經(jīng)誘導(dǎo)的BL21/pET-32a全菌蛋白；3—誘導(dǎo)的BL21/pET-32a全菌蛋白；4—未誘導(dǎo)的BL21/32a-ORF8全菌蛋白；5—誘導(dǎo)的BL21/32a-ORF8全菌蛋白。M—predyed standard molecular weight protein Marker; 1—total cell protein of BL21; 2—uninduced total cell protein of BL21/pET-32a; 3—induced total cell protein of BL21/pET-32a; 4—uninduced total cell protein of BL21/32a-ORF8; 5—induced total cell protein of BL21/32a-ORF8.圖4 AngHV-FJ ORF8在大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of the expression of AngHV-FJ ORF8 in Escherichia coli

2.5 ORF8蛋白的純化

收集誘導(dǎo)表達(dá)的ORF8蛋白條帶，用PAGE-膠蛋白微量回收試劑盒純化后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，與含32a-ORF8的誘導(dǎo)菌全菌蛋白相比，回收蛋白為與ORF8蛋白大小一致的單一條帶，表明成功獲得了高純度的ORF8表達(dá)蛋白(圖5)。

3 討論

3.1 AngHV-FJ ORF8基因序列的特征

生產(chǎn)實(shí)踐中，AngHV給鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)者造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[16]，但學(xué)界目前對于該病毒的研究還不深入。AngHV是具囊膜的雙鏈DNA病毒，囊膜蛋白可參與病毒包膜和宿主細(xì)胞膜間的膜融合[17-19]，對病毒囊膜蛋白進(jìn)行研究，可以加深人類對宿主與病毒關(guān)系的認(rèn)識，有助于闡明其發(fā)病機(jī)制，制定有效的防治策略[11]。本研究中克隆了AngHV的ORF8基因，并對ORF8基因及其編碼的蛋白特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，ORF8基因編碼蛋白穩(wěn)定性較好，親水性較強(qiáng)，存在跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，且存在多個抗原表位，符合囊膜蛋白的基本特征。在進(jìn)一步的研究中將對蛋白進(jìn)行功能鑒定，以探討其在病毒感染中的具體作用。

M—預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker；1—純化的ORF8蛋白；2—誘導(dǎo)的BL21/32a-ORF8全菌蛋白。M—predyed standard molecular weight protein Marker; 1—the purified ORF8 protein; 2—induced total cell protein of BL21/32a-ORF8.圖5 回收純化AngHV ORF8蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified AngHV ORF8 protein

3.2 AngHV-FJ ORF8基因的表達(dá)時序

皰疹病毒在感染過程中，基因按照表達(dá)時序性一般分為3種類別——極早期基因(immediate-early gene, IE)、早期基因(early gene, E)和晚期基因(late gene, L)[20-21]，但三者間無較明確的界限[22]。一般來說，皰疹病毒的早期基因在病毒感染后的2～4 h開始表達(dá)[23]。本研究中顯示,ORF8的轉(zhuǎn)錄本在病毒感染3 h即檢測到，在感染24 h后達(dá)到峰值，因此，該基因可能在病毒感染和復(fù)制的早期就發(fā)揮作用[22]。

3.3 AngHV-FJ ORF8蛋白表達(dá)的應(yīng)用

準(zhǔn)確的病原診斷是病毒疾病預(yù)防和治療的基礎(chǔ)。目前，相關(guān)領(lǐng)域已建立了多種基于PCR的AngHV檢測方法[24]，但還未見免疫學(xué)檢測方法的報(bào)道。病毒的囊膜蛋白多具有良好的免疫原性[25-27]，如CyHV-2[28-31]、CyHV-3[32-35]和鯽皰疹病毒(Carassius auratus herpesvirus, CaHV)[36],常應(yīng)用于建立相應(yīng)的免疫學(xué)檢測方法和作為制備亞單位疫苗的抗原。因此，本研究在分析ORF8抗原表位的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了ORF8在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并獲得了高純度的純化蛋白。表達(dá)的蛋白與預(yù)期大小一致，說明ORF8蛋白可能并不存在翻譯后修飾，這為下一步的抗體制備、免疫效果評價(jià)及免疫學(xué)診斷方法的建立奠定了前期基礎(chǔ)，對于鰻鱺皰疹病毒疾病的防控研究具有重要意義。