江超峰，李悝悝，李唐，車佳，3，尹恒*

(1.中科院大連化學物理研究所 遼寧省碳水化合物重點實驗室，大連市糖類農用制劑工程研究中心，遼寧 大連 116023； 2.中國科學院大學 化學科學學院，北京 100049； 3.大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023)

α-半乳糖苷酶(α-Gal; EC3.2.1.22)是可專一性水解α-半乳糖苷鍵的糖苷水解酶，如棉子糖家族(RFOs)、半乳甘露聚糖、刺槐豆膠、瓜爾豆膠等[1]。基于氨基酸序列，α-半乳糖苷酶在碳水化合物活性酶(CAZy)數(shù)據(jù)庫(http://www. cazy.org)中歸屬為糖苷水解酶(GH)家族中的第4、27、36、57、97、110家族[2]。其中，大多數(shù)α-半乳糖苷酶屬于GH27和GH36，目前，這兩個家族的酶也是α-半乳糖苷酶中研究最廣泛的[3]。而GH4家族中α-半乳糖苷酶主要來源于古細菌和細菌，目前研究相對較少。研究人員發(fā)現(xiàn)，大部分被報道的GH4家族酶活性依賴于NAD+及二價陽離子，有些還需要依賴如二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇等還原劑，到目前為止，只在GH4家族中發(fā)現(xiàn)了這種依賴NAD+進行糖苷水解反應的酶[4]?；诘孜锾禺愋裕?半乳糖苷酶主要被分為兩大類。一類針對低分子量的底物起作用，如4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNP-α-Gal，pNPG)、蜜二糖、水蘇糖和棉子糖；另一類則對高聚合度的半乳甘露聚糖和低分子量底物都起作用[5]。

在食品行業(yè)中，α-半乳糖苷酶被廣泛應用，制糖產業(yè)中棉子糖的存在會抑制甜菜糖漿中蔗糖的結晶,生產過程中，通過加入α-半乳糖苷酶進行酶促反應消耗棉子糖，能明顯提高產率[6]。

海洋中含有豐富的多糖資源與獨特的微生物體系，因此，海洋來源的微生物是多糖降解酶的重要來源之一。本研究中，從海洋鹿角菜中篩選得到蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus，獲得了一個新的GH4 α-半乳糖苷酶基因BcgalA，成功構建重組質粒，轉入大腸桿菌宿主中進行誘導表達和純化，測定了其對pNP-α-Gal與棉子糖的活性，以期為探究GH4 α-半乳糖苷酶的結構與功能提供樣本，同時也為α-半乳糖苷酶的工業(yè)應用提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

蠟樣芽孢桿菌由遼寧省大連市黑石礁海域腐爛鹿角菜中篩選得到。EscherichiacoliTop10和EscherichiacoliBL21(DE3)由中科院大連化物所1805組實驗室保存。

pNP-α-Gal、pNP、棉子糖購自Sigma-Aldrich公司 (USA)；限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher公司(USA)；Prime STAR HS DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶購自寶生物(大連)工程有限公司；DNA全基因提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；葫蘆巴膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠均購自上?？略瓕崢I(yè)有限公司。

LB培養(yǎng)基(液體，1 L)中含有Tryptone 10 g、Yeast Extract 5 g、NaCl 10 g，pH為7.0；固體培養(yǎng)基中含有15 g瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 蠟樣芽孢桿菌α-半乳糖苷酶基因BcgalA的克隆 根據(jù)蠟樣芽孢桿菌α-半乳糖苷酶BcgalA在NCBI上的序列(登錄號WP_002170672.1)，設計C-末端帶有6 ×His-tag 基因的一對引物，BcgalA-F：5′GCGCGCCATGGCAAAAATTACATTT 3′；BcgalA-R：5′CGAGCTCGAGGATTGTC TCCACAACTGCTTC 3′，下劃線分別為NcoI 和XhoI的酶切位點。以蠟樣芽孢桿菌DNA為模板，克隆BcgalA基因。 PCR反應體系(100 μL)：模板DNA 1.5 μL，10 mmol/L基因特異性引物4 μL，Prime STAR HS DNA聚合酶0.5 μL，dNTP Mixture(各10 mmol/L) 8 μL，5×PS Buffer 20 μL，用ddH2O補足至100 μL。PCR反應條件： 95 ℃下預變性 3 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，68 ℃下退火復性30 s(每個循環(huán)降0.5 ℃)，72 ℃下延伸3.5 min，共進行30 個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。PCR擴增產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離、DNA膠回收試劑盒進行膠回收。

1.2.2 表達載體的構建 膠回收產物在37 ℃下用NcoI和XhoI 雙酶切消化6 h，與同樣酶切后的pET28a通過T4 DNA 連接酶室溫連接12 h，將產物轉入E.coliTOP 10 感受態(tài)細胞，在含Kan抗性的平板上37 ℃下生長過夜，用通用引物5′TAATACGACTCACTATAGG和3′GCTAGTTATTGCTCAG- CGG進行菌落PCR驗證后，提取質粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，將測序正確的質粒命名為pET28a-BcgalA，再將其轉入E.coliBL21(DE3)中。

1.2.3BcGalA誘導表達與表達條件優(yōu)化 挑取轉入BcgalA的E.coliBL21(DE3)單菌落，接入10 mL 含50 μg/mL Kan 的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩過夜培養(yǎng)，按1∶50的比例接種于含50 μg/mL Kan的500 mL LB 液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃擴大培養(yǎng)。當菌液OD600 nm為0.6～0.8時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，200 r/min、30 ℃誘導培養(yǎng)12 h。優(yōu)化后誘導條件改為180 r/min、16 ℃誘導表達24 h，以12 000 r/min離心10 min后收集菌體。

1.2.4 重組蛋白純化 將超聲破碎收集獲得的菌體(300 W，超聲/間隔時長 3 s/15 s，30 min)，在4 ℃下以12 000 r/min冷凍離心40 min，收集上清液。經Ni-NTA親和層析柱純化蛋白，即用Bind Buffer(0.1 mol/L pH 7.4 Tris-HCl、0.3 mmol/L MnCl2、1 mmol/L TCEP)平衡柱子，取上清液上樣，用Bind Buffer沖洗柱子后，依次用含40 mmol/L、250 mmol/L咪唑的Bind Buffer洗脫收集，上清液沉淀與洗脫液均由10%(質量分數(shù))SDS-PAGE分析蛋白分離純化，蛋白質量濃度由Bradford法測定。

1.2.5BcGalA活性的測定 采用pNPG法[7]與DNS法[8]測定酶活性，采用DNS法測定天然產物的活性。

pNPG法是以OD405 nm值(y)為縱坐標，硝基苯酚(pNP)含量(x)為橫坐標，繪制標準曲線。

將pNPG溶于緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、3 mmol/L MnCl2、5 mmol/L NAD+、1 mmol/L TCEP)中，使其終濃度為100 mmol/L，取2 μL酶液(8.91 mg/mL)與100 μL的pNPG混合。37 ℃下溫育10 min，加入800 μL 0.5 mol/L的Na2CO3終止反應，最后加入100 μL的ddH2O。于405 nm處測定OD值，用pNP生成量來表示酶活力。對照組加滅活的酶液，其余操作與試驗組相同。

DNS法是以OD540 nm值(y)為縱坐標，半乳糖含量(x)為橫坐標，繪制標準曲線。

用相同緩沖液配制5 g/L天然產物的底物溶液，取2 μL酶液(8.91 mg/mL)與100 μL底物混合。37 ℃下反應40 min，加入100 μL DNS終止反應，煮沸10 min，最后加入800 μL的ddH2O，于540 nm處測定OD值，用半乳糖生成量表示酶活力，對照組加滅活的酶液，其余操作與試驗組相同。

單位酶活定義：37 ℃下1 min釋放1 μmol的半乳糖需要的酶量定義為一個酶活單位(U)。

1.2.6 生物信息學分析 通過生物信息學分析，對α-半乳糖苷酶結構域及理化性質等方面進行分析與預測[9]。α-半乳糖苷酶BcgalA基因序列編碼的氨基酸理化性質及親疏水性預測由ExPASy網站(https://web.expasy.org/protparam/)在線完成。通過ENDscript/ESPript(http://espript.ibcp.fr/ ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)對序列進行比對作圖。用Mega7.0軟件構建進化樹[10]。

2 結果與分析

2.1 BcgalA基因的克隆

通過PCR擴增獲得C-末端連接6×His-tag的BcgalA基因，獲得一條約1 300 bp條帶(圖1)，符合BcgalA基因全長1 326 bp，并將其切膠回收。

M—核酸標準BM5000+；1—α-半乳糖苷酶基因擴增產物。M—Marker;1—amplification product of α-galactosidase gene.圖1 α-半乳糖苷酶基因的電泳檢測Fig.1 Electrophoretic detection of α-galactosidase gene

2.2 表達載體的構建

將BcgalA與pET28a質粒連接后轉入E.coliTOP10感受態(tài)細胞中，提取質粒進行基因測序，將測序結果匹配的重組質粒命名為pET28a-BcgalA。

2.3 BcgalA基因及其編碼氨基酸序列分析

BcgalA基因全長為1 326 bp，其編碼的BcGalA蛋白由441個氨基酸組成，該蛋白的理論相對分子質量為50 380，等電點為6.12，總平均親水性為-0.379，不穩(wěn)定指數(shù)為35.98，屬于穩(wěn)定蛋白。

2.4 BcGalA誘導表達與條件優(yōu)化

超聲破碎誘導表達后的菌體，離心獲得含有目的蛋白的上清液。如圖2(a)所示，通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，30 ℃、200 r/min誘導獲得的BcGalA，主要以包涵體的形式存在，因此，優(yōu)化誘導表達條件，通過降低誘導時轉速與溫度達到減少包涵體的目的。如圖2(b)所示，16 ℃、180 r/min誘導獲得的BcGalA，大部分存在于上清液中，通過優(yōu)化誘導表達條件，減少了蛋白包涵體，提高了上清液中的蛋白含量，為后續(xù)蛋白純化、酶活力測定等試驗奠定了基礎。

M—Marker；1—誘導前上清液；2—誘導后上清液；3—誘導后沉淀；4—流穿液；5—粗酶；6—破菌后沉淀；7—40 mmol/L咪唑洗脫液；8—250 mmol/L咪唑洗脫液。M—Marker；1—supernatant before induction；2—supernatant after induction；3—insoluble fractions after induction；4—remaining components after passing through the Ni column；5—crude extract of BcGalA；6—insoluble fractions of cell extract of BcGalA；7—eluent of 40 mmol/L imidazole；8—eluent of 250 mmol/L imidazole.圖2 BcGalA純化結果Fig.2 Purification of BcGalA

2.5 BcGalA分離純化

目的蛋白的C端帶有6×His-tag，因此，采用Ni-NTA親和層析柱分離純化BcGalA。從圖2(b)可見，用40 mmol/L咪唑洗脫大部分雜蛋白后，250 mmol/L 咪唑能夠成功洗脫目的蛋白，且條帶單一，與目的蛋白BcGalA大小基本一致。

2.6 BcGalA活性檢測

對純化后的蛋白進行Buffer置換與蛋白濃縮，測得其蛋白質量濃度為8.91 mg/mL，并進行酶活力鑒定，如表1所示。在37 ℃、pH 8.0條件下，BcGalA酶水解pNP-α-Gal、棉子糖的比活力分別為(1.498±0.034)、(0.261±0.012)U/mg，但對半乳甘露聚糖無水解活性。

2.7 BcGalA的進化樹構建與多序列比對

將BcGalA與GH4家族中其他來源的α-半乳糖苷酶進行比對，采用鄰接法(Neighbor-joining method)構建系統(tǒng)進化樹(bootstrap為1 000)，結果發(fā)現(xiàn)，BcGalA與來源于枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis的α-半乳糖苷酶聚為一支，親緣關系最近(圖3)。但該枯草芽孢桿菌來源的α-半乳糖苷酶僅進行了基因測序與功能注釋，尚未開展其他研究。

表1 BcGalA底物特異性Tab.1 Substrate specificity of BcGalA

圖3 GH4家族不同來源α-半乳糖苷酶的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree showing the relationship between BcGalA and α-galactosidase from other sources of GH4

將BcGalA與其他GH4中的α-半乳糖苷酶及6-磷酸-β-葡萄糖苷酶進行多序列比對，結果如圖4所示,發(fā)現(xiàn)BcGalA中含有GXGS與NAD+結合的“指紋”模體，驗證了BcGalA為GH4家族中的α-半乳糖苷酶。

3 討論

3.1 BcGalA酶學性質比較

本研究中，在活性測定過程中發(fā)現(xiàn)，與GH4家族中來源于Bacillusmegateriu的BmelA相同[11]，BcGalA在堿性條件下才具有活性，在pH為6.8的Tris-HCl緩沖液中BcGalA基本不具活性，這與其他傾向于在酸性或中性pH條件下發(fā)生反應的大部分α-半乳糖苷酶不同(表2)。此外，與其他菌株來源的α-半乳糖苷酶相比，除嗜熱的芽孢桿菌，同樣來源于海洋的巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium的α-半乳糖苷酶在能夠耐受稍高溫度的情況下，最適溫度則相對偏低，猜測是因為該酶來源于海洋細菌，故最適溫度不高。通常海洋來源細菌中的α-半乳糖苷酶具有20～40 ℃最適較低溫度的特征，利于在腸道溫度下反應的食品和飼料中應用。

Mel4A—來源于Bacillus halodurans (Accession: NP 243094)的α-半乳糖苷酶; MelA—來源于 Escherichia coli K12 (Accession: NP 418543)的α-半乳糖苷酶；CelF—來源于Escherichia coli (Accession: P17411)的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶；▲—預測的NAD+結合氨基酸殘基。Mel4A—α-galactosidase from Bacillus halodurans (Accession: NP 243094); MelA—α-galactosidase from Escherichia coli K12 (Accession: NP 418543); CelF—6-phosphate-β-glucosidase from Escherichia coli (Accession: P17411)；▲—predicted NAD + binding amino acid residues.圖4 源于GH4家族糖苷水解酶氨基酸的序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment derived from GH4 glycoside hydrolase

表2 部分α-半乳糖苷酶的酶學性質Tab.2 Several enzyme properties of α-galactosidase

3.2 BcGalA底物特異性

本研究中，對α-半乳糖苷酶BcGalA底物特異性進行測定顯示，BcGalA水解pNP-α-Gal、棉子糖的比活力分別為(1.498±0.034)、 (0.261±0.012)U/mg(表1)，這表明，BcGalA酶對pNP-α-Gal的水解活力高于對棉子糖的活力；而BcGalA對葫蘆巴膠、瓜爾豆膠、刺槐豆膠等聚糖無水解活性，說明BcGalA是一種只能降解低分子量底物的α-半乳糖苷酶，這種底物特異性與同樣為GH4家族來源于E.coli的K12MelA[21]及來源于Bacillushalodurans的重組Mel4A(rMel4A)類似[2]，其原因可能是這些α-半乳糖苷酶的底物結合口袋不足以容納更大分子量的底物。目前，針對α-半乳糖苷酶分為降解低聚寡糖和半乳甘露聚糖兩類的原因尚不明確，通過底物共結晶等方式研究降解機制有助于了解α-半乳糖苷酶結構與降解模式的關系，加深對α-半乳糖苷酶的理解。此外，Heravi等[22]發(fā)現(xiàn)了Bacillussubtilis利用棉子糖家族(RFOs)的系統(tǒng)，同時也觀察到在BacillusmegateriumVHM1中，該系統(tǒng)無法被更復雜的底物(如瓜爾豆膠或刺槐豆膠)誘導[23]。因此，推測在Bacilluscereus中也存在類似的棉子糖利用系統(tǒng)，僅由棉子糖等寡糖進行誘導，無法由聚糖誘導，而BcGalA在通路下游起到利用這些寡糖的作用。

3.3 BcGalA具有GH4水解酶特征

在水解糖苷鍵時需要NAD+，這種情況是GH4家族中的酶所特有的[24]，同時研究發(fā)現(xiàn)，GXGS模體對NAD+的結合和活性均有至關重要的作用[25]。Yip等[26]探究了GH4家族需要NAD+與二價金屬離子的原因，NAD+的存在表明存在氧化還原反應，與通用的糖苷酶機制不一致，金屬離子在催化過程中不被消耗，并且在催化反應的末期未形成NADH，該水解反應不存在直接親核取代步驟。該機制涉及陰離子過渡態(tài)，而不是在其他糖苷酶機制中廣泛存在的陽離子過渡態(tài)，解釋了GH4家族需要NAD+與金屬離子的原因。從該家族的底物可以觀察到廣泛的底物特異性，是因為催化的關鍵位置在底物的C2和C3周圍，而不是底物異頭異構中心附近，且其具體催化位點并不確定，需要通過活性位點結構的微小變化適應廣泛的底物特異性，因此，本研究中，通過特定的NAD+結合位點來判斷是否屬于GH4，結果顯示，BcGalA具有GH4水解酶特征(圖4)。

4 結論

1)海洋中含有豐富的多糖資源，海洋微生物是多糖降解酶的重要來源。本研究中從海洋來源的蠟樣芽孢桿菌中克隆得到一個屬于糖苷水解酶第4家族的α-半乳糖苷酶基因BcgalA，并利用基因工程技術將目的基因重組到表達載體pET28a上，成功構建了大腸桿菌原核表達菌株。

2)誘導表達的BcGalA純化后成功獲得了單一且清晰的條帶，在37 ℃、pH 8.0條件下測得對pNPG-α-Gal、棉子糖的比活力分別為(1.498±0.034)、(0.261±0.012) U/mg，并對半乳甘露聚糖無活性，屬于GH4中能降解寡糖而不能降解聚糖的α-半乳糖苷酶，與目前結構已解析的α-半乳糖苷酶同源性較低，揭示其具有獨特的降解機制，具有進一步研究的價值。