譚月，邱明，李金龍，左陸雅，吳婉婷，霍忠明,2*，閆喜武,2

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 遼寧 大連 116023； 2.遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum隸屬于軟體動物門Mollusca雙殼綱Veneroida簾蛤科Veneridae蛤仔屬Ruditapes，俗稱蛤蜊、蜆子、花蛤等[1]，是中國四大養(yǎng)殖貝類之一，中國年產(chǎn)量約300萬t，占世界總產(chǎn)量的90%以上，市場潛力巨大。目前，中國菲律賓蛤仔種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)不清、北黃海等灘涂土著地方種質(zhì)丟失、人工培育的良種覆蓋率低等問題制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。理清中國菲律賓蛤仔野生群體及潛在可作修復(fù)用途的日本、朝鮮群體的種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)，開展蛤仔種質(zhì)資源保護(hù)和可持續(xù)利用，可成為解決目前所存問題的主要途徑。

動物線粒體DNA 由于具有分子量小、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡單、母性遺傳等特點(diǎn)[2]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的種質(zhì)遺傳研究中[3]。而16S rRNA 是線粒體基因組中既含有高度保守和中度保守的序列區(qū)域，又含有高度變化序列區(qū)域的一段序列，因此，被認(rèn)為是科級以下水平物種間親緣關(guān)系和系統(tǒng)演化研究的有效標(biāo)記[4]。目前，利用線粒體DNA基因序列進(jìn)行菲律賓蛤仔遺傳多樣性的研究已有較多報(bào)道，胡利莎等[5]研究了10個菲律賓蛤仔野生群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明，中國沿海的菲律賓蛤仔野生群體存在一定的遺傳分化，遼寧大連群體和山東榮成群體聚為一支,其余8個群體聚為一支。劉相全等[6]對菲律賓蛤仔和雜色蛤仔Ruditapesvariegata的線粒體16S rRNA 基因序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，兩種菲律賓蛤仔的親緣關(guān)系比較接近, 且與同為簾蛤科的硬殼蛤Mercenariamercenaria有明顯的差異。在國外，Cordero等[7]結(jié)合線粒體細(xì)胞色素C氧化酶(COI)基因序列及SSR(簡單重復(fù)序列)遺傳標(biāo)記對1936年由日本引種至北美西海岸的菲律賓蛤仔群體的種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行了評估。這些研究均為菲律賓蛤仔的種質(zhì)資源保護(hù)提供了參考。

目前，關(guān)于中國菲律賓蛤仔野生苗種產(chǎn)區(qū)的廣西北海、山東萊州、遼寧營口、天津群體，以及日本北海道、朝鮮新義州海域潛在可作為北黃海土著地方品種資源修復(fù)用途的群體的種質(zhì)資源狀況尚無報(bào)道。本研究中，利用16S rRNA序列多態(tài)性分析了中國4個野生苗種產(chǎn)區(qū)群體及日本北海道、朝鮮新義州群體的菲律賓蛤仔遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)[8]，以期為菲律賓蛤仔種質(zhì)資源保護(hù)及可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

菲律賓蛤仔樣本(表1)分別采自中國遼寧營口(YK)、天津(TJ)、山東萊州(LZ)、廣西北海(BH)、日本北海道(JH)和朝鮮新義州(NKS)，每個地區(qū)收集10個個體，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行解剖，取其足和閉殼肌，使用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇固定，保存于冰箱(-20 ℃)中。

表1 菲律賓蛤仔6個群體的樣本信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物工程有限公司)提取菲律賓蛤仔基因組DNA，提取的DNA通過核酸定量儀檢測濃度，并通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，儲存于-20 ℃用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 菲律賓蛤仔線粒體16S rRNA基因擴(kuò)增所用的引物序列如下[9]：

正向16S rRNA：5′CGCCTGTTTAHYAAAAACAT 3′；

反向16S rRNA：5′CCGGTCTGAACTCAGMTCAYG 3′。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系(50 μL)：100 ng的DNA模板5 μL， Mix(寶生物工程(大連)有限公司)25 μL，正、反向引物各2 μL，用去離子水定容至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，56 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min；4 ℃下結(jié)束。每個PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測，驗(yàn)證條帶。所有經(jīng)驗(yàn)證的PCR產(chǎn)物均采用TaKaRa MiniBEST 瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒進(jìn)行純化，然后使用ABI 3730 xl DNA分析儀測序系統(tǒng)(生工生物工程(上海)股份有限公司)對PCR引物進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序完成后，采用DNAMAN軟件手工檢測和修剪DNA序列。采用DnaSP 5.10.01軟件對菲律賓蛤仔進(jìn)行遺傳多樣性分析[10]、中性測試及種群動態(tài)分析。采用MEGA 7軟件[9]計(jì)算群體間的 K2P(Kimura-2-parameter) 遺傳距離，并利用UPGMA法繪制單倍型遺傳聚類樹。采用Arlequin 3.0軟件[11]計(jì)算核苷酸組成、群體間遺傳分化指數(shù)(F-statistics，F(xiàn)ST)。通過POPART[12-14](http://www.http://POPART.otago.ac.nz/index.shtml)進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)分析。設(shè)置菲律賓蛤仔16S rRNA基因序列的置信閾值為95%，用于不同地理群體單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。采用DNASP軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Nexfile文件格式，用POPART構(gòu)建菲律賓蛤仔Median-joining (MJ)[13]網(wǎng)絡(luò)圖，以檢測不同地理群體菲律賓蛤仔間的遺傳關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔16S rRNA 基因片段堿基組成及單倍型分析

將測序序列剪切至相同長度的535 bp進(jìn)行分析。6個地理群體16S rRNA 序列的平均堿基組成：T為33.46%，C為10.82%，A為33.79%，G為21.92%，A+T為67.26%。A+T含量依次為YK(67.36%)>LZ(67.28%)>TJ(67.25%)>JH(67.24%)>NPS(67.22%)>BH(67.18%)，堿基偏倚顯著，A+T含量顯著高于G+C含量，且與線粒體堿基組成一致。

根據(jù)DnaSP 5.0 軟件的分析結(jié)果，在菲律賓蛤仔6個地理群體中共獲得16S rRNA 基因的單倍型20個，為Hap-1～Hap-20。其中，從單倍型來看，Hap-1、Hap-3、Hap-9和Hap-14 4個單倍型為共享單倍型，其余16個單倍型為群體的獨(dú)享單倍型(表2)。

共享單倍型中，Hap-1 出現(xiàn)頻率最高，為中國北方的營口(YK)、萊州(LZ)、天津(TJ)，以及朝鮮新義州(NKS)和日本北海道(JH)群體所共有，占所有檢測個體的46.67%；Hap-3為中國營口(YK)、萊州(LZ)、天津(TJ)、北海(BH)群體所共有；從不同地理群體來看，營口(YK)和天津(TJ)群體的單倍型數(shù)量最豐富，各自有7個單倍型，日本北海道(JH)群體的單倍型數(shù)量最少，只有2個單倍型，其余群體的單倍型數(shù)量為3～6個(表2)。

表2 菲律賓蛤仔16S rRNA 基因序列的單倍型序列比對及在不同群體中的分布

2.2 菲律賓蛤仔不同地理群體16S rRNA基因的遺傳多樣性分析

從表3可見：從各地理群體來看，基于16S rRNA基因片段，天津(TJ)、營口(YK)和萊州(LZ)群體的單倍型多樣性(Hd)較高，分別為0.911、0.867和0.867，朝鮮新義州(NKS)和日本北海道(JH)群體單倍型多樣性(Hd) 較低，均為0.378；營口(YK)群體的平均核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(K)在6個群體里最高，分別為0.010 60和5.578，日本北海道(JH)群體在6個群體里最低，分別為0.000 75和0.400。

2.3 菲律賓蛤仔單倍型發(fā)生關(guān)系

菲律賓蛤仔群體的單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖如圖1(a)所示，6個群體單倍型呈分散狀態(tài)，各個單倍型連接點(diǎn)間節(jié)點(diǎn)較多，單倍型分支呈現(xiàn)星狀分布，其中，Hap-1和Hap-3分別處于2個集中分支的中心，且所占比例較大，由此可推測，這兩個單倍型為菲律賓蛤仔的原始單倍型。

如圖1(b)所示，單倍型在群體中分布網(wǎng)絡(luò)圖能更加直觀地顯示單倍型在不同地理群體中的分布和系統(tǒng)演化關(guān)系， 4個共享單倍型(Hap-1、Hap-3、Hap-9和Hap-14)分別分散在不同地理群體中。

表3 菲律賓蛤仔6個不同地理群體mtDNA 16S rRNA 基因的遺傳多樣性分析

圖(a)中每個圓的大小與總單倍型頻率成正比；圖(b)中扇區(qū)的顏色代表不同的單倍型，扇區(qū)的大小代表該地點(diǎn)出現(xiàn)此單倍型的頻率。

根據(jù)菲律賓蛤仔6個群體的線粒體16S rRNA基因片段，構(gòu)建20個單倍型Neighbor-joining (NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。其中，共享單倍型Hap-1分布在YK、LZ、TJ、NKS和JH群體中，Hap-3分布在營口(YK)、萊州(LZ)、北海(BH)和天津(TJ)群體中，Hap-9分布在萊州(LZ)、北海(BH)和天津(TJ)群體中，Hap-14分布在北海(BH)和天津(TJ)群體中。在20個單倍型中存在2個優(yōu)勢單倍型(Hap-1和Hap-3)，分別占個體數(shù)的46.67%和18.33%。

2.4 群體間遺傳距離與遺傳分化

從表4可見，6個群體間的K2P遺傳距離均小于0.01，未達(dá)到種間分化水平。采用16S rRNA基因序列的遺傳分化系數(shù)(FST)對群體間關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明：中國北方營口(YK)、萊州(LZ)、天津(TJ)3個群體間遺傳分化不明顯，南方北海群體(BH)與萊州(LZ)、營口(YK)群體間存在顯著的遺傳分化(P<0.05)，但與天津(TJ)群體間遺傳分化不顯著(P>0.05)；朝鮮新義州(NKS)與日本北海道(JH)群體間遺傳分化不顯著(P>0.05)，兩群體與北方營口(YK)和萊州(LZ)群體間遺傳分化也不顯著(P>0.05)，但與天津(TJ)和北海(BH)群體間遺傳分化顯著(P<0.05)。

YK—營口群體；LZ—萊州群體；BH—北海群體；TJ—天津群體；NKS—新義州群體；JH—北海道群體。群體名前的數(shù)字代表群體中出現(xiàn)的個體數(shù)。YK—Yingkou population； LZ—Laizhou population；BH—Beihai population；TJ—Tianjin population；NKS—Sinuiju population；JH—Hokkaido population.The number represents the number of individuals present in the populations.圖2 20種單倍型在6個群體中的分布及其系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Distribution of 20 haplotypes and NJ molecular phylogenetic tree in 6 populations

2.5 種群動態(tài)分析

通過線粒體16S rRNA基因?qū)Ψ坡少e蛤仔不同地理群體進(jìn)行錯配分析。錯配分析(Mismatch distribution)曲線圖可以對種群的歷史動態(tài)進(jìn)行分析，當(dāng)種群為新形成或近期發(fā)生擴(kuò)張時，其錯配分析曲線呈單峰；當(dāng)種群為一個長期穩(wěn)定的群體時，錯配分析曲線出現(xiàn)多個峰值。本研究結(jié)果顯示(圖3)，6個群體均呈現(xiàn)雙峰或多峰，6個地理群體在近期未發(fā)生快速擴(kuò)張，群體處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

表4 菲律賓蛤仔6個地理群體間K2P遺傳距離(上三角)和遺傳分化系數(shù)(FST) (下三角)

圖3 基于16S rRNA 基因菲律賓蛤仔6個地理群體的錯配分布分析Fig.3 Mismatch distribution analysis of 6 populations of Manila clam Ruditapes philippinarum based on 16S rRNA gene

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

本研究中對菲律賓蛤仔線粒體16S rRNA基因片段單倍型進(jìn)行分析， 6個群體共檢測到20個單倍型，包括4個共享單倍型和16個獨(dú)享單倍型，這說明不同地理群體有部分基因交流的同時，也存在一定程度遺傳分化。其中，共享單倍型Hap-1發(fā)生頻率最高，在群體中分布最廣，故認(rèn)為該單倍型是最原始的單倍型，能夠適應(yīng)環(huán)境變化并在群體中保持穩(wěn)定存在。

遺傳多樣性是指物種內(nèi)部和物種間的遺傳變異程度，是生物適應(yīng)環(huán)境和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)。單倍型多樣性描述了樣品間的等位基因差異，而核苷酸多樣性代表了DNA序列間核苷酸差異的平均數(shù)量[15]。單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)是衡量遺傳多樣性的兩個重要參數(shù)[16]。一般來說，存在4種情況：

1) 單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)的變異均較低(Hd<0.5，Pi<0.005)時，意味著最近發(fā)生過群體瓶頸效應(yīng)或由單一、少數(shù)群體所產(chǎn)生的建立者效應(yīng)。

2) 單倍型多樣性指數(shù)較高而核苷酸多樣性指數(shù)較低(Hd>0.5，Pi<0.005)時，預(yù)示著群體曾經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)后，伴隨了迅速的群體擴(kuò)張與變異的積累。

3) 單倍型多樣性指數(shù)較低而核苷酸多樣性指數(shù)較高(Hd<0.5，Pi>0.005)時，提示可能是來自兩個獨(dú)立群體發(fā)生的二次接觸所導(dǎo)致，或者是一個大而穩(wěn)定的群體中發(fā)生過瓶頸效應(yīng)。

4) 高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性指數(shù)均較高(Hd>0.5，Pi>0.005)時，表明一個大而穩(wěn)定的群體是經(jīng)過長時間演化或是兩個不同系群的群體二次接觸所產(chǎn)生的[17]。

本研究中，檢測到朝鮮NKS和日本JH群體遺傳多樣性指數(shù)均較低(Hd<0.5，Pi<0.005)，其原因可能是群體建立者效應(yīng)，2個群體在相對較短的時間內(nèi)獲得核苷酸變異的個體，但在短時間內(nèi)核苷酸出現(xiàn)變異的數(shù)量不足，導(dǎo)致群體中核苷酸多樣性降低，使其群體遺傳多樣性下降。另外，也可能是由于本研究中樣本數(shù)量較少導(dǎo)致2個群體遺傳多樣性降低，在以后的研究中，應(yīng)擴(kuò)大群體樣本數(shù)量，并結(jié)合其他分子標(biāo)記和基因組測序方法，對這兩個群體遺傳多樣性開展進(jìn)一步分析。天津、營口、萊州和廣西群體具有較高的遺傳多樣性，這反映了其具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和較大的遺傳變異潛力。

物種的遺傳多樣性與其對環(huán)境的適應(yīng)能力、物種進(jìn)化潛力及生存能力密切相關(guān)。遺傳多樣性豐富的物種面對環(huán)境變化時具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在物種進(jìn)化方面表現(xiàn)出較好的潛力，而遺傳多樣性的匱乏對于種質(zhì)資源保護(hù)和利用產(chǎn)生諸多不利影響。本研究中，根據(jù)單倍型遺傳多樣性、遺傳及群體動態(tài)分析，在6個群體中，天津(TJ)、營口(YK)、萊州(LZ)群體的單倍型個數(shù)、單倍型多樣性和核酸多樣性較高，北海(BH)群體遺傳多樣性次之，朝鮮新義州(NKS)和日本北海道群體(JH)遺傳多樣性較低。菲律賓蛤仔在相鄰海域內(nèi)存在廣泛的基因交流。中國人工異地移養(yǎng)菲律賓蛤仔活動對本地野生群體基因資源產(chǎn)生了一定影響。

3.2 群體遺傳距離與遺傳分化

K2P方法主要用來計(jì)算種間水平的遺傳距離[18]，一般種內(nèi)K2P遺傳距離小于0.01，只有個別物種的種內(nèi)遺傳距離大于0.02[19-22]。但K2P方法并不能準(zhǔn)確反映群體間的遺傳分化程度[18-19]。因此，本研究中首先使用 K2P方法檢測不同群體間菲律賓蛤仔遺傳距離，再使用FST評估群體間遺傳分化程度。本研究表明，6個群體的遺傳距離均小于0.01，并未達(dá)到種間分化水平。FST可以用于群體間遺傳分化程度的評估，其值為-1～1，兩個群體間FST值越大，表示兩個群體的遺傳分化程度越高[23]。一般認(rèn)為，00.25表示群體間分化程度極大。本研究中6個野生地理群體FST值為-0.040 79～0.566 67，中國南方北海群體與中國北方群體(除天津群體)、日本群體和朝鮮群體遺傳分化顯著，6個群體可劃分為南、北2個譜系，即中國南方北海群體為南方譜系，其他5個群體為北方譜系。在前期的研究報(bào)道中，陳辰等[24]將毛蚶Scapharcasubcrenata劃分為南、北方2個群系，這可能是由于中國長江淡水形成的天然屏障阻斷了海洋貝類南、北方自然種群的基因交流，同一貝類物種在不同的地理格局，經(jīng)過上萬年的隔離和群體演化，形成了具有明顯特征的南、北方譜系。

菲律賓蛤仔幼蟲浮游時間長(2～3周)、分布空間廣、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)的特點(diǎn)，提高了群體擴(kuò)張和基因交流的效率。Cordero等[6]發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔日本群體自1936年被引入北美加拿大不列顛哥倫比亞海岸后，經(jīng)過30余年的繁衍即擴(kuò)張到美國南加利福尼亞州。Chiesa等[25]報(bào)道，1972年被引種到法國、英國、意大利、西班牙等歐洲沿岸的菲律賓蛤仔與本地土著品種發(fā)生了基因漸滲。本研究中，北海道群體和新義州群體的蛤仔遺傳分化程度較低，可能與選擇的分子標(biāo)記有關(guān)，在今后的研究中可采用具有較高多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記對群體遺傳多樣性進(jìn)行分析；在明顯的南北方譜系中，南方北海群體與北方天津群體遺傳分化不顯著，這兩個群體均存在共享單倍型Hap-14，這可能與天津海域人工移養(yǎng)菲律賓蛤仔南方苗種有關(guān)[26]，在此過程中，南方北海群體與北方群體得到了一定程度的基因交流；在北方譜系中，天津群體與日本、朝鮮群體均分化顯著，天津與日本、朝鮮群體除了北方特有單倍型Hap-1外無其他共享單倍型，天津群體與北海群體有3個共享單倍型(Hap-3、Hap-9和Hap-14)，說明天津群體由于人工移養(yǎng)南方苗種發(fā)生基因交流密切，由此與日本、朝鮮群體產(chǎn)生顯著分化。中國北方營口、天津及萊州群體間遺傳分化不顯著，這可能與其在同一海域相互間廣泛的基因交流有關(guān)。結(jié)合本研究的遺傳分化和共享單倍型地理分布結(jié)果，分析中國北方3個群體、朝鮮新義州和日本北海道群體的基因流為距離隔離模式(Isolation-By-Distance Model)，即菲律賓蛤仔屬于活動范圍有限，出生到死亡基本無較大移動范圍的物種，各個群體在空間上連續(xù)分布，由于受個體間隨機(jī)交配范圍的限制，基因頻率在相鄰群體間差異小，不同群體在地理位置和遺傳距離間存在聯(lián)系。

3.3 種質(zhì)資源的保護(hù)

根據(jù)本研究結(jié)果，今后的研究工作中可以將天津、營口、萊州和北海野生群體作為主要研究對象，利用線粒體COI基因序列及SSR(簡單重復(fù)序列)等分子標(biāo)記,以及SLAF(特異位點(diǎn)擴(kuò)增片段)簡化基因組技術(shù)對群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。日本朝鮮群體，種內(nèi)檢測到的遺傳變異水平較低，基于該分子標(biāo)記檢測出蛤仔北海道和新義州群體遺傳分化不顯著，這可能與選擇的分子標(biāo)記有關(guān)，在今后的研究中可采用核基因標(biāo)記(微衛(wèi)星標(biāo)記)進(jìn)行分析。在進(jìn)一步確定種質(zhì)優(yōu)良的蛤仔群體基礎(chǔ)上，通過原良種場建設(shè)等方法，對種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)，同時可以將原種場自然野生苗種進(jìn)行有計(jì)劃的采捕和換區(qū)移養(yǎng)，最終達(dá)到可持續(xù)利用目的。

4 結(jié)論

1) 菲律賓蛤仔天津、營口、萊州及北海4個群體具有較豐富的遺傳多樣性，朝鮮新義州和日本北海道群體遺傳多樣性較低。

2) 6個群體可劃分為南、北方譜系，即北海群體為南方譜系，其他5個群體為北方譜系；中國北方3個群體(營口、天津和萊州)及日本、朝鮮群體間存在距離隔離模式基因流。

3) 中國人工異地移養(yǎng)菲律賓蛤仔活動對本地野生群體基因資源產(chǎn)生一定影響。