薛國(guó)亮，張 聰，鄭桂麗，王 俊

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，約占癌癥總死亡的18.4%[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lunch cancer，NSCLC）是肺癌中最常見的病理類型。雖然近年來肺癌的診療技術(shù)有所發(fā)展，但是5 年生存率仍然不高[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類沒有開放閱讀框的序列高度保守且不編碼蛋白的類信使RNA轉(zhuǎn)錄本[3]。既往研究顯示，LncRNA 通過調(diào)控微RNA（microRNA，miRNA）參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。核糖核酸酶P RNA 組分H1（ribonuclease P RNA component H1，RPPH1）是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡中發(fā)揮重要作用[6]，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[7]、糖尿病腎病[8]和腫瘤[9]等疾病有關(guān)。RPPH1 在人體組織中廣泛表達(dá)，可參與結(jié)直腸癌[9]、乳腺癌[10]、白血病[11]和食管鱗癌[12]等的進(jìn)展。既往少有研究報(bào)道RPPH1 在肺癌中的作用及其機(jī)制。miR-143-3p 在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)，能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[13]。本研究分析RPPH1 通過miR-143-3p 對(duì)NSCLC 細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，旨在探討RPPH1 在NSCLC 發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

NSCLC 細(xì) 胞Calu-3 和肺腺 癌A549 細(xì) 胞以及正常人支氣管內(nèi)皮細(xì)胞HBE 均購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。RPMI 1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自上海語純生物科技有限公司，LipofectAMINETM2000 試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。特異性針對(duì)RPPH1 的shRNA（shRPPH1）和陰性對(duì)照（negative control，NC）shRNA（shNC）、miR-143-3p-抑制子（inhibitor）、miR-143-3p-模擬物（mimics）以及攜帶有RPPH1 的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-RPPH1 均購(gòu)自山東維真生物科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒均購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海語純生物科技有限公司。引物均由廣州伯信生物科技有限公司設(shè)計(jì)并提供。鼠抗人細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Bax、剪切型（cleaved）-caspase 3 和GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體（二抗）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2 組織樣本

選取2018 年6 月—2019 年10 月由山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的35 例NSCLC 患者手術(shù)切除的肺癌組織及其癌旁組織（距離癌組織≥5 cm）?；颊咝g(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療。所有患者均簽署知情同意書。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)組織和細(xì)胞中RPPH1 的表達(dá)水平

采用TRIzol 法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，并通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備獲得cDNA，隨后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 min；94 ℃ 15 s、55℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，用2-△△Ct法計(jì)算RPPH1 的相對(duì)表達(dá)量。RPPH1 上游引物序列為3’-CGAGCTGAGTGCGTCCTGTC-5’，下游引物序列為3’-TCGCTGGCCGTGAGTC TGT-5’；U6（內(nèi)參照）上游引物序列為5’-AT TGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；miR-143-3p 上游引物序列為5’-AACATTCA TTGCTGTCGGTG-3’，下游引物序列為5’-GC TGTCAACGATACGCTACGT-3’。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

使用LipofectAMINETM2000 試劑盒將特異性針對(duì)RPPH1 的shRNA（shRPPH1 組）及陰性對(duì) 照shNC（shNC 組）轉(zhuǎn) 入Calu-3 和A549 細(xì)胞，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。首先制備LipofectAMINETM2000 復(fù)合物和DNA 復(fù)合物（每孔加入4 μL 濃度為1 μg/μL的重組質(zhì)粒和246 μL 無血清培養(yǎng)液），隨后將2 者混勻，溫室靜置20 min。將混合物加入6 孔板中，溫室培養(yǎng)6 h 后更換為含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。shRPPH1 序列為5’-GGACAACGCCGGUUAUGAA-3’，shNC 序列為5’-GC CAGCACCATGCTCTTCTA-3’。隨后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中RPPH1 的表達(dá)水平，方法同1.3 節(jié)。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

克隆形成實(shí)驗(yàn)：使用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的Calu-3 和A549 細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔的密度接種于6 孔板中，細(xì)胞分組及處理同1.4 節(jié)；將各組細(xì)胞置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，30 min后用結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下計(jì)算克隆數(shù)。

CCK-8 法：細(xì)胞的分組及處理同克隆形成實(shí)驗(yàn)，待細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 和96 h 時(shí)，在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK-8 試劑，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)490 nm 處檢測(cè)各組細(xì)胞的D值。

1.6 FCM 法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率

將轉(zhuǎn)染后的Calu-3 和A549 細(xì)胞制成1×106個(gè)/mL 的懸液，細(xì)胞分組及處理同1.4 節(jié)。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Annexin Ⅴ（Annexin Ⅴ-FITC）/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）用500 μL 預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液稀釋后配制成工作液，隨后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻后孵育10 min；再加入2.5 μL PI，孵育5 min。最后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞（細(xì)胞分組及處理同1.4 節(jié)），用RAPI 裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，并用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取適量蛋白，行10%SDS-PAGE 分離蛋白，并將分離后的蛋白用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。隨后，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理2 h，加入一抗[鼠抗人cyclin B1（體積稀釋比例為1 ∶500）、PCNA（體積稀釋比例為1 ∶200）、Bax（體積稀釋比例為1 ∶500）、cleaved-caspase 3（體積稀釋比例為1 ∶500）和GAPDH（內(nèi)參照）（體積稀釋比例為1 ∶500）單克隆抗體]，4 ℃反應(yīng)過夜孵育，次日除去一抗；用TBST 緩沖液洗滌3 次，加入二抗[HRP-羊抗鼠IgG（工作液體積稀釋比例為1 ∶1 000）]，溫室反應(yīng)1 h。加入電化學(xué)發(fā)光劑后，在發(fā)光儀下進(jìn)行蛋白成像。應(yīng)用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照GAPDH 蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 RPPH1 與miR-143-3p 靶向關(guān)系的預(yù)測(cè)和鑒定

應(yīng)用miRNA 靶向預(yù)測(cè)軟件TargetScan 進(jìn)行檢索，發(fā) 現(xiàn)RPPH1 與miR-143-3p 有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確定2 者的靶向關(guān)系。將RPPH1 突變型（mutanttype，MUT）熒光酶報(bào)告載體（PGLO-RPPH1-MUT）、野生型（wild-type，WT）熒光素酶報(bào)告載 體（PGLO-RPPH1-WT）、miR-143-3p-模擬物（miR-143-3p-mimics）和陰性對(duì)照模擬物（NC-mimics）兩兩組合后共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，檢測(cè)熒光素酶活性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證RPPH1 與miR-143-3p 的靶向關(guān)系，首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將NC-mimics（對(duì)照組）、miR-143-3p-mimics 和miR-143-3pinhibitor 分別轉(zhuǎn)入Calu-3 和A549 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染流程同1.4 節(jié)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中RPPH1 的表達(dá)水平，檢測(cè)流程同1.3 節(jié)。隨后，采用脂質(zhì)體法將空載體pcDNA3.1（對(duì)照組）以及重組載體pcDNA3.1-RPPH1，shNC（對(duì)照組）和shRPPH1 分別轉(zhuǎn)入Calu-3 和A549 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染流程同1.4 節(jié)，同樣采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-143-3p 的表達(dá)水平，檢測(cè)流程同1.3 節(jié)。

1.9 調(diào)控RPPH1 和miR-143-3p 表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

將Calu-3 和A549 細(xì)胞均分為3 組：shNC+NC-mimics 組、shRPPH1+NC-mimics 組 和shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 組。按組別，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將shNC、shRPPH1、NCmimics（作為miR-143-3p-mimics 和miR-143-3pinhibitor 的共同對(duì)照）和miR-143-3p-inhibitor分別轉(zhuǎn)入Calu-3 和A549 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染流程同1.4節(jié)。隨后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中miR-143-3p 的表達(dá)水平（方法同1.3 節(jié)），克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力（方法同1.5 節(jié)），F(xiàn)CM 法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡能力（方法同1.6 節(jié)），最后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（方法同1.7 節(jié)）。

Fig.1 The expression levels of long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1(RPPH1) in 35 non-small cell lunch cancer (NSCLC) tissues and their adjacent tissues,NSCLC cells (Calu-3 and A549) and normal human bronchial endothelial HBE cells (as the control) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.*P＜0.05,vs HBE cells (n=4).圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)RPPH1 在NSCLC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)4 次，計(jì)量資料以表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)以及采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RPPH1 在NSCLC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，NSCLC 組織中RPPH1 的相對(duì)表達(dá)量為2.39±0.58，明顯高于癌旁組織的0.93±0.45（P＜0.001）。Calu-3 和A549 細(xì)胞中RPPH1 的相對(duì)表達(dá)量分別為3.78±0.54 和2.77±0.47，明顯高于HBE 細(xì)胞的1.04±0.19，（P均＜0.001）。這一結(jié)果提示，RPPH1 可能參與NSCLC 的發(fā)生。

2.2 RPPH1 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)果（圖2A）顯示，在Calu-3 細(xì)胞中，shRPPH1 組的RPPH1 相對(duì)表達(dá)量為0.27±0.08，低于shNC 組的0.96±0.20（P＜0.05）；在A549 細(xì)胞中，shRPPH1 組 的RPPH1 相對(duì)表達(dá)量為0.31±0.09，低于shNC組的0.95±0.17（P＜0.001）。這一結(jié)果提示，shRPPH1 能有效沉默Calu-3 和A549 細(xì)胞中RPPH1 的表達(dá)水平。

CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果（圖2B）顯示，48、72 和96 h 時(shí)，在Calu-3 和A549 細(xì)胞中，shRPPH1 組細(xì)胞的增殖能力均低于shNC 組（P均＜0.05）。

Fig.2 The effects of long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1)silencing on cell proliferation and apoptosis of non-small cell lunch cancer (NSCLC) cells (Calu-3 and A549).A: The expression levels of RPPH1 in Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting RPPH1 (shRPPH1) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR;B-C: The proliferation abilities of Calu-3 and A549 cells after RPPH1 silencing were detected by CCK-8 method (B) and colony formation test (C);D: The apoptotic rates of Calu-3 and A549 cells after RPPH1 silencing were detected by flow cytometry (FCM).Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC) (shNC)as the controls.*P＜0.05,vs shNC group (n=4).圖2 沉默RPPH1 表達(dá)對(duì)NSCLC Calu-3 和A549 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（圖2C）顯示，在Calu-3 細(xì)胞中，shRPPH1 組細(xì)胞的克隆數(shù)為（51.00±14.12）個(gè)，低于shNC 組的（100.23±38.73）個(gè)（P＜0.05）；在A549 細(xì)胞中，shRPPH1 組細(xì)胞的克隆數(shù)為（42.37±12.18）個(gè)，低于shNC 組的（107.15±41.72）個(gè)（P＜0.05）。

FCM 法檢測(cè) 結(jié)果（圖2D）顯 示，在Calu-3 細(xì)胞中，shRPPH1 組細(xì)胞的凋亡率為（16.78±3.71）%，高于shNC 組的（6.08±1.27）%（P＜0.05）；在A549 細(xì)胞中，shRPPH1 組細(xì)胞的凋亡率為（15.01±3.43）%，高于shNC 組的（5.14±1.87）%（P＜0.05）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，在Calu-3 細(xì)胞中，shRPPH1 組 中cyclin B1 和PCNA 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.47±0.09和0.43±0.07，均低于shNC 組的0.91±0.15和1.12±0.17（P均＜0.001）；shRPPH1 組 中Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.88±0.09 和1.21±0.10，均高于shNC 組的0.48±0.09 和0.37±0.06（P均＜0.001）。在A549 細(xì)胞中，shRPPH1 組中cyclin B1 和PCNA 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.12 和0.55±0.11，均低于shNC 組 的0.83±0.08 和1.04±0.11（P均＜0.001）；shRPPH1 組中的Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.11 和1.20±0.16，均高于shNC 組的0.63±0.07 和0.58±0.06（P均＜0.001）。

Fig.3 The expression levels of cell proliferation and apoptosis-related proteins [cyclin B1,proliferating cell nuclear antigen (PCNA),Bax and cleaved-caspase 3] in Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1) were detected by Western blotting.Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC) (shNC) as the controls.*P＜0.05,vs shNC group (n=4).圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)沉默RPPH1 表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 驗(yàn)證RPPH1 靶向miR-143-3p

TargetScan 預(yù)測(cè)到RPPH1 和miR-143-3p 具有結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果（圖4B）顯示，miR-143-3p-mimics 可以明顯抑制PGLO-RPPH1-WT 的熒光素酶活性，而miR-143-3p-inhibitor 可以增強(qiáng)PGLO-RPPH1-WT 的活性（P均＜0.05）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果（圖4C）顯示，轉(zhuǎn)入miR-143-3p-mimics 后可使miR-143-3p 表達(dá)水平上調(diào)，繼而下調(diào)RPPH1 的表達(dá)水平；而轉(zhuǎn)入miR-143-3p-inhibitor 后可使miR-143-3p 表達(dá)水平下調(diào)，繼而上調(diào)RPPH1 的表達(dá)水平（P均＜0.05）。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果（圖4D）顯示，轉(zhuǎn)入重組載體pcDNA3.1-RPPH1 可上調(diào)RPPH1 的表達(dá)水平，繼而下調(diào)miR-143-3p的表達(dá)水平；而轉(zhuǎn)入shRPPH1 可下調(diào)RPPH1 的表達(dá)水平，繼而上調(diào)miR-143-3p 的表達(dá)水平（P均＜0.05）。

上述結(jié)果提示，RPPH1 可以靶向作用于miR-143-3p。

Fig.4 The targeting relationship between long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1) and microRNA (miR)-143-3p.A: The binding sites of RPPH1 and miR-143-3p were analyzed by TargetScan.B: The targeting relationship between RPPH1 and miR-143-3p was identified by double luciferase reporter gene system.*P＜0.05,vs NC-mimics group (n=4).C: The expression levels of RPPH1 in Calu-3 and A549 cells transfected with miR-143-3p-mimics or miR-143-3p-inhibitor were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Calu-3 and A549 cells were transfected with NCmimics as the control.*P＜0.05,NC-mimics (n=4).D: The expression levels of miR-143-3p in Calu-3 and A549 cells transfected with recombinant plasmid pcDAN3.1-RPPH1 or shRPPH1 were detected by realtime fluorescence quantitative PCR.Calu-3 and A549 cells were transfected with empty vector pcDAN3.1 or shNC as the control groups.*P＜0.05,vs pcDAN3.1;ΔP＜0.05,vs shNC (n=4).圖4 RPPH1 與miR-143-3p 靶向關(guān)系的驗(yàn)證

2.4 調(diào) 控RPPH1 和miR-143-3p 的表達(dá) 對(duì)Calu-3 和A549 細(xì)胞增殖和凋亡的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（圖5A）顯示，Calu-3 細(xì)胞中shNC+NC-mimics 組克隆形成數(shù)為（109.67±21.98）個(gè)，shRPPH1+NC-mimics組為（40.12±10.09）個(gè)，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 組為（103.65±33.78）個(gè)；與shNC+NC-mimics 組相比，shRPPH1+NC-mimics 組細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯抑制（P＜0.05）；與shRPPH1+NC-mimics 組相比，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 組細(xì)胞的克隆形成能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。A549 細(xì)胞中shNC+NCmimics 組克隆 形成數(shù) 為（96.07±15.52）個(gè)，shRPPH1+NC-mimics 組 為（41.78±10.14）個(gè)，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 組 為（90.67±20.03）個(gè)；與shNC+NC-mimics 組相比，shRPPH1+NC-mimics 組細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯抑制（P＜0.05）；與shRPPH1+NC-mimics 組相比，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 組細(xì)胞的克隆形成能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，沉默RPPH1 表達(dá)后，Calu-3 和A549 細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯抑制，而再抑制miR-143-3p 表達(dá)后能夠提高Calu-3 和A549 細(xì)胞的克隆形成能力。

CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果（圖5B）顯示，96 h 時(shí)shNC+NC-mimics 組Calu-3 細(xì)胞的D值 為1.29±0.16，轉(zhuǎn)染shRPPH 后（shRPPH1+NCmimics 組）D值降至0.65±0.05（P＜0.05）；而同時(shí)轉(zhuǎn)染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor后，D值上升 至1.24±0.06（P＜0.05）。96 h時(shí)shNC+NC-mimics 組A549 細(xì)胞的D值 為1.32±0.05，轉(zhuǎn)染shRPPH 后（shRPPH1+NCmimics 組）D值降至0.75±0.10（P＜0.05）；而同時(shí)轉(zhuǎn) 染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，D值上升至1.29±0.10（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，沉默RPPH1 表達(dá)后，Calu-3 和A549 細(xì)胞的增殖能力均受到明顯抑制，而再抑制miR-143-3p 表達(dá)后能夠提高Calu-3 和A549 細(xì)胞的增殖能力。

Fig.5 The cell proliferation and apoptotic rate of Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1) (shRPPH1) or shRPPH1+microRNA (miR)-143-3p were detected by colony formation assay (A),CCK-8 assay (B) and FCM method (C),respectively.Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC)(shNC) +NC-mimimcs as the control.*P＜0.05,vs shNC+NC-mimics group;ΔP＜0.05,vs shRPPH1+NCmimics group (n=4).圖5 RPPH1 靶向miR-143-3p 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響

FCM 法檢測(cè)結(jié)果（圖5C）顯示，shNC+NC-mimics 組Calu-3 細(xì)胞凋 亡率為（4.83±1.34）%，轉(zhuǎn)染shRPPH 后（shRPPH1+NC-mimics 組）細(xì)胞凋亡率升高至（15.11±2.10）%（P＜0.05）；而同時(shí)轉(zhuǎn)染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，細(xì)胞凋亡率下降至（3.95±1.67）%（P＜0.05）。shNC+NC-mimics 組A549 細(xì)胞凋亡率為（3.24±0.90）%，轉(zhuǎn) 染shRPPH后（shRPPH1+NC-mimics 組 ）升高至（13.02±1.21）%（P＜0.05）；而同時(shí)轉(zhuǎn)染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，細(xì)胞凋亡率下降至（3.69±1.11）%（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，沉默RPPH1 表達(dá)后Calu-3 和A549 細(xì)胞的凋亡能力均明顯增強(qiáng)；而抑制miR-143-3p表達(dá)后，Calu-3 和A549 細(xì)胞的凋亡能力均明顯受到抑制。

Fig.6 The expression levels of cell proliferation-related protein [cyclin B1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)] and apoptosis-related protein (Bax and cleaved-caspase 3] in Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1(RPPH1) were detected by Western blotting.Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC) (shNC) as the control.*P＜0.05,vs shNC+NC-mimics group;ΔP＜0.05,vs shRPPH1+NCmimics group (n=4).圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RPPH1 靶向miR-143-3p 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，shNC+NC-mimics 組Calu-3 細(xì)胞中cyclin B1 和PCNA蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.90±0.13 和0.98±0.07，凋亡相 關(guān)蛋白Bax 和cleaved-caspase 3的表達(dá)量分別為0.23±0.04 和0.67±0.09；轉(zhuǎn)染shRPPH 后（shRPPH1+NC-mimics 組 ），cyclin B1 和PCNA 的表達(dá)量分別下調(diào)至0.45±0.12 和0.37±0.08，而Bax 和cleaved-caspase 3的表達(dá)量分別上調(diào)至1.00±0.12 和1.21±0.18（P均＜0.05）；同時(shí)轉(zhuǎn) 染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，cyclin B1 和PCNA 的 表達(dá)量分別上調(diào)至0.93±0.15 和1.01±0.09，而Bax 和cleaved-caspase 3 的表達(dá)量分別下調(diào)至0.34±0.08 和0.68±0.10（P均＜0.05）。shNC +NC-mimics 組A549 細(xì)胞中cyclin B1 和PCNA 蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.92±0.14 和0.97±0.10，Bax 和cleaved-caspase 3 的表達(dá) 量分別為0.41±0.09 和0.61±0.10；轉(zhuǎn)染shRPPH后（shRPPH1+NC-mimics 組），cyclin B1 和PCNA 的表達(dá)量分別下調(diào)至0.34±0.09 和0.41±0.05（P均＜0.05），Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白的表達(dá)量分別上調(diào)至0.98±0.11 和1.03±0.14（P均＜0.05）；同時(shí)轉(zhuǎn)染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，cyclin B1 和PCNA 的表達(dá) 量分別上調(diào)至0.95±0.10 和1.02±0.12，Bax 和cleaved-caspase 3 的表達(dá)量分別下調(diào)至0.52±0.06和0.59±0.09（P均＜0.05）。

上述結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染shRPPH1+NCmimics 后，Calu-3 和A549 細(xì)胞的增殖能力以及增殖相關(guān)蛋白cyclin B1 和PCNA 的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bax 和cleaved-caspase 3 的表達(dá)水平均明顯上調(diào)；共轉(zhuǎn)染shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 可通過下調(diào)miR-143-3p 的表達(dá)水平而逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。這一結(jié)果提示，shRPPH1 可負(fù)調(diào)控miR-143-3p 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。

3 討論

LncRNA 是一種非編碼RNA，存在于所有生命形式中，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中均發(fā)揮重要作用[14]。越來越多的研究表明，LncRNA 在NSCLC 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-17]。RPPH1 是新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，本研究結(jié)果顯示RPPH1 在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，這與WU 等[16]報(bào)道的結(jié)果一致，提示RPPH1 可能參與NSCLC的發(fā)生。細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡是影響腫瘤進(jìn)展的重要因素，而RPPH1 又與之密切相關(guān)[6,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)RPPH1 的表達(dá)可以抑制Calu-3細(xì)胞和A549 細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，說明RPPH1 可能參與了NSCLC 的進(jìn)展。

RPPH1 是核糖核酸酶P 的一個(gè)RNA 亞單位，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和周期調(diào)控中均發(fā)揮重要作用[6]，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[7]、糖尿病腎病[8]和腫瘤[9]等疾病有關(guān)。RPPH1 在腫瘤中的作用機(jī)制目前尚未明確。LIANG 等[9]發(fā)現(xiàn)，RPPH1 可以通過與TUBB3 基因相互作用，促進(jìn)外泌體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)生M2 型極化，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。LncRNA 靶向調(diào)控miRNA 是其發(fā)揮作用的重要途徑。有報(bào)道顯示，下調(diào)RPPH1 可以抑制miR-122 的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[10]。類似地，LEI 等[11]也發(fā)現(xiàn)RPPH1 能夠通過miR-300-5-p 促進(jìn)急性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

本研究前期通過TargetScan 預(yù)測(cè)到RPPH1與miR-143-3p 存在結(jié) 合位點(diǎn)。miR-143-3p 在NSCLC 中的作用及其機(jī)制既往已有大量報(bào)道。miR-143-3p 可能通 過VASH1[18]、MAPK7[19]和FOSL2[20]等信號(hào)通路發(fā)揮作用。為證實(shí)RPPH1對(duì)miR-143-3p 的靶向調(diào)控作用，本研究首先利用了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，隨后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染shRPPH1 以及陰性對(duì)照后，Calu-3 和A549 細(xì)胞增殖能力明顯下降以及cyclin B1 和PCNA 蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，而細(xì)胞凋亡率以及Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增加；而共轉(zhuǎn)染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。上述結(jié)果說明，PPH1 可能通過靶向miR-143-3p 促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。

綜上所述，本研究證實(shí)RPPH1 可能通過負(fù)調(diào)控miR-143-3p 而參與NSCLC 的發(fā)生和發(fā)展，提示RPPH1/miR-143-3p 軸可能成為NSCLC 潛在治療靶點(diǎn)。本研究仍存在一定的局限性，例如未分析RPPH1 與NSCLC 臨床病理特征、療效和預(yù)后的關(guān)系，同時(shí)未檢測(cè)miR-143-3p 下游基因的變化。因此，未來需要進(jìn)一步開展動(dòng)物學(xué)和臨床上的研究，以明確RPPH1 在NSCLC 中的作用機(jī)制及意義。