王仲秋，耿 莉，李承學(xué)，郝希偉

腎母細胞瘤是兒童常見的惡性腫瘤之一，占所有兒童腎臟腫瘤的95%，其發(fā)病率約為1/10 萬人[1]。臨床上，約10%的腎母細胞瘤患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移或在術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[1]。深入分析腎母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展機制，對指導(dǎo)臨床診療具有重要的意義。甲基化轉(zhuǎn)移酶與腎母細胞瘤密切相關(guān)，其基因多態(tài)性可能影響疾病易感性[2]。甲基轉(zhuǎn)移酶樣7B（methyltransferase-like 7B，METTL7B）是甲基轉(zhuǎn)移酶樣家族成員之一，其基因位于人類12 號染色體上，編碼的蛋白廣泛表達于人體各組織。既往研究發(fā)現(xiàn)，METTL7B與膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、乳腺癌和非小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3-6]。既往鮮見METTL7B 與腎母細胞瘤相關(guān)的研究報道，因此本研究首先檢測了腎母細胞瘤組織中METTL7B 的表達情況，并且分析了METTL7B 表達與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，隨后采用小RNA 干擾技術(shù)靶向沉默METTL7B基因，同時探討其對腎母細胞瘤細胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

人腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞和正常腎上皮細胞系（PCS-400-010、PCS-400-011 和PCS-400-012）均購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，當SK-NEP-1 細胞融合度達80%時進行傳代。

DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、Tris/EDTA 修復(fù)液和SP 免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自上海語純生物科技有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipoFiterTM購自美國Sigam 公司。兔抗人METTL7B 和GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 購自英國Abcam 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒、BCA 蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒、CCK-8 試劑盒、Transwell 小室和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的Annexin Ⅴ（Annexin Ⅴ-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。siMETTL7B 和陰性對照（negative control，NC）siRAN（siNC）均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

組織冷凍切片機（BL-800 W 型）和流式細胞儀（LSR Ⅱ型）為美國BD 公司產(chǎn)品，實時熒光定量PCR 儀（ABI7500 型）為美國賽默飛公司產(chǎn)品，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（ChemiDoc XRS 型）為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡（CX33 型）為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.2 組織樣本

以2008 年1 月—2013 年6 月山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟南人民醫(yī)院兒科收治的72 例腎母細胞瘤患者為研究對象，其中男性29 例、女性43例；平均年齡為（3.62±1.03）歲（范圍：10 月齡～12 歲）；美國兒童腫瘤協(xié)作組（Children’s Oncology Group，COG）分期為I～Ⅱ期者40例，Ⅲ～Ⅴ期者32 例；病理分型為預(yù)后良好型（favorable histology，F(xiàn)H）者38 例，預(yù)后不良型（unfavorable histology，UFH）者34 例。所有患者均接受手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療方法，并經(jīng)術(shù)后病理確診。將手術(shù)切除的腎母細胞瘤組織及其配對的癌旁正常腎組織（距離腫瘤組織邊緣＞5 cm）制作成石蠟標本，切片厚度為4 μm。

1.3 隨訪

術(shù)后對所有患者進行門診和電話隨訪，記錄生存情況。術(shù)后第1～2 年，每3 個月復(fù)查1 次；術(shù)后第3 年，每4 個月復(fù)查1 次；術(shù)后第4 年，每6 個月復(fù)查1 次；術(shù)后第5 年及以后，每年復(fù)查1 次。隨訪截止日期為2019 年6 月30 日。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測METTL7B 的表達情況

取腎母細胞瘤組織及其配對的癌旁正常腎組織石蠟切片，70 ℃烤片30 min，常規(guī)脫蠟處理。用Tris/EDTA 修復(fù)液進行抗原修復(fù)，隨后用含羊血清的封閉液封閉處理30 min；加入兔抗人METTL7B 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶500），4 ℃孵育過夜；隨后加入二抗和鏈霉素-卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；最后用DAB 顯色，并進行蘇木精復(fù)染。經(jīng)過脫水、透明和封片處理等步驟后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞染色情況。每一張切片隨機選取10 個視野，每一個視野計數(shù)100 個細胞，根據(jù)細胞的染色強度及陽性細胞所占百分比判斷METTL7B 蛋白的表達情況。染色強度評分：陰性為0 分、淺黃色為1 分、棕黃色為2 分、棕褐色為3 分；陽性細胞所占百分比評 分：0%～10% 為1 分、11%～50% 為2 分、51%～80%為3 分、81%～100%為4 分；將染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相乘，0～3 分代表低表達，4～12 分代表高表達[7]。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞中METTL7B 蛋白的表達水平

取對數(shù)生長期的各組細胞（SK-NEP-1、PCS-400-010、PCS-400-011 和PCS-400-012），加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min，12 000×g離心15 min 后收集上清液；用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。取適量蛋白行10% SDS-PAGE 分離蛋白，并將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用封閉液封閉處理1 h；加入一抗[兔抗人METTL7B單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶500）和兔抗人GAPDH 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）]，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，隨后加入二抗[辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶500）]，溫室孵育2 h，再用TBST 洗膜3 次。最后加入電化學(xué)發(fā)光劑顯影成像，用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

SK-NEP-1 細胞培養(yǎng)至融合度為80%時，除去培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細胞2 次。加入1 mL胰蛋白酶消化處理1 min 后加入2 mL DMEM培養(yǎng)液，將細胞吹打成細胞懸液，以5×102個/mL 的密度將細胞接種至6 孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5% 的條件下培養(yǎng)24 h；用無血清培養(yǎng)液分別稀釋LipoFiter 和siMETTL7B（或siNC）后將2 者混勻，靜置5 min；將混合物加入6 孔培養(yǎng)板中進行轉(zhuǎn)染，6 h 后進行后續(xù)實驗，具體流程參數(shù)參閱試劑盒提供的操作說明。siMETTL7B 正義鏈序列為5’-AUUAGAUCCAUAGUCAUACGG-3’，反義鏈序列為5’-GUAUGACUAUGGAUCUA AUUC-3’；siNC 正義鏈序列為5’-GAUGAUUC CUUCAGGGUUA-3’，反義鏈序列為5’-GCA CAAACCCAGGCUAUUU-3’。

1.7 實時熒光定量PCR 檢測METTL7B 基因的沉默效率

采用TRIzol 法提取細胞中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后用實時熒光定量試劑盒進行PCR 擴增。PCR 擴增條件為95 ℃30 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用2-△△Ct法計算METTL7B mRNA 相對表達量。METTL7B基因上游引物序列為3’-C GAGCTGAGTGCGTCCTGTC-5’，下游引 物序列為3’-TCGCTGGCCGTGAGTCTGT--5’；GAPDH基因（內(nèi)參照）上游引物序列為5’-CTAC AATGAGCTGCGTGTGGC-3’，下游引物序列為5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’。

1.8 克隆形成實驗和CCK-8 法檢測細胞的增殖活力

克隆形成實驗：使用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的SK-NEP-1 細胞，收集細胞接種于6 孔板中（3×103個/孔），置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)3 周；當出現(xiàn)菌落時，停止培養(yǎng)[8]；使用4%多聚甲醛溶液固定SK-NEP-1 細胞，30 min 后用結(jié)晶紫染色；將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)＞50 個細胞的克隆數(shù)。

CCK-8 實驗：使用CCK-8 試劑盒檢測SKNEP-1 細胞增殖活性；細胞培養(yǎng)24、48 和72 h時，向每一個培養(yǎng)孔中避光加入5 μL CCK-8 溶液，培養(yǎng)2 h，用酶標儀（490 nm 波長）讀取吸光度值[9]。實驗重復(fù)3 次。

1.9 FCM 法檢測細胞凋亡情況

取對數(shù)生長期的SK-NEP-1 細胞，制成1×106個/mL 的細胞懸液，隨后加 入5 μL FITC-Annexin Ⅴ，混勻后再加入5 μL PI，溫室下避光孵育10 min 后，使用FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)3 次。

1.10 Transwell 小室實驗檢測細胞的侵襲能力

在Transwell 小室的上室膜上鋪設(shè)matrigel，隨后將細胞接種于Transwell 小室的上室中（1×103個/孔）；下室中加入細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h 后取出Transwell 小室，用棉簽擦拭除去未穿過小室膜的細胞，使用多聚甲醛溶液固定黏附于下室微孔膜下面的SK-NEP-1 細胞，用結(jié)晶紫染色15 min，待干燥后，在光學(xué)顯微鏡（放大倍數(shù)為100 倍）下選取5 個視野，觀察染色細胞的形態(tài)并計數(shù)。

1.11 細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力

取對數(shù)生長期的SK-NEP-1 細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，待SK-NEP-1 細胞融合度達80%時，用無菌槍頭進行劃痕。分別于0 和24 h 時，在光學(xué)顯微鏡下測量劃痕寬度并拍照。劃痕愈合率（%）＝（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%[10]。實驗重復(fù)3 次。

Fig.1 The expression levels of methyltransferase-like 7B (METTL7B) protein in nephroblastoma tissues and their normal adjacent kidney tissues (A) and nephroblastoma SK-NEP-1 cells and normal renal epithelial cells (PCS-400-010,PCS-400-011 and PCS-400-012) (B) were detected by immunohistochemistry(DAB staining,×200) and Western blotting,respectively. *P＜0.05,vs SK-NEP-1 cells.圖1 分別采用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測METTL7B 蛋白在腎母細胞瘤組織及其癌旁正常腎組織（A）和腎母細胞瘤細胞（B）中的表達水平

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對所有的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗）；生存分析采用Kaplan-Meier 法，預(yù)后相關(guān)因素的單因素和多因素分析采用COX風(fēng)險比例模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.13 倫理學(xué)

本研究通過山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬濟南人民醫(yī)院倫理委員會批準。患者及其家屬均簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 METTL7B 在腎母細胞瘤組織和細胞中的表達

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果（圖1A）顯示，METTL7B 陽性染色可見于細胞核和細胞質(zhì)中。腎母細胞瘤組織中METTL7B 高表達，陽性表達率為68.06%（49/72），高于癌旁正常腎組織的16.67%（12/72）（χ2＝38.937，P＜0.001）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖1B）顯示，SK-NEP-1 細胞中METTL7B 蛋白的表達量為2.78±0.12，明顯高于PCS-400-010 細胞的0.45±0.23、PCS-400-011 細胞中 的0.37±0.14以及PCS-400-012 細胞的0.38±0.24 細胞（F＝39.090，P＜0.001）。

2.2 METTL7B 與腎母細胞瘤患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

統(tǒng)計分析結(jié)果（表1）顯示，METTL7B 與COG 分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑和病理分型均無關(guān)（P均＞0.05）。

表1 METTL7B 表達與腎母細胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between methyltransferase-like 7B (METTL7B) expression and clinicopathological features of patients with nephroblastoma(N ＝72,n)

COX單因素和多因素分析結(jié)果（表2）顯示，COG 分期為Ⅲ～Ⅳ期、病理分型為UFH 型和METTL7B 高表達是腎母細胞瘤不良預(yù)后的獨立影響因素（P＜0.05）。

表2 腎母細胞瘤患者預(yù)后的單因素和COX 多因素分析Table 2 Univariate and COX multivariate analyses of prognosis of patients with nephroblastoma

Fig.2 Kaplan Meier method was used to analyze the correlation between methyltransferase-like 7B(METTL7B) expression and overall survival (OS) of patients with nephroblastoma.圖2 Kaplan-Meier 法分析METTL7B 表達與腎母細胞瘤患者生存的相關(guān)性

Fig.3 The expression levels of methyltransferase-like 7B (METTL7B) mRNA (A) and protein (B) in SK-NEP-1 cells transfected with siMETTL7B targeting METTL7B gene were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.SK-NEP-1 cells were transfected with siRNA negative control (NC) (siNC) as the control.*P＜0.05,vs siNC group (n=3).圖3 分別采用實時熒光定量PCR 法和蛋白質(zhì)印跡法檢測SK-NEP-1 細胞中METTL7B mRNA（A）和蛋白（B）的表達水平

Kaplan-Meier 生存曲線分析結(jié)果（圖2）顯示，METTL7B 高表達患者的生存時間短于METTL7B 低表達的患者（P＜0.05）。

2.3 沉默METTL7B 基因表達對SK-NEP-1 細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果（圖3A）顯示，在SK-NEP-1 細胞中，siNC 組和siMETTL7B組的METTL7B mRNA 表達量分別為1.89±0.11和0.57±0.12；與siNC 組相比，siMETTL7B組METTL7B mRNA 的表達水平明顯下調(diào)（P＜0.001）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖3B）顯示，在SK-NEP-1 細胞中，siNC 組 和siMETTL7B 組的METTL7B 蛋白表達量分別為2.34±0.34 和0.68±0.23；與siNC 組相比，siMETTL7B 組METTL7B 蛋白的表達水平明顯下調(diào)（P＜0.001）。

克隆形成實驗檢測結(jié)果（圖4A）顯示，siNC組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的克隆形成數(shù)分別為（240.56±35.10）個和（123.12±27.80）個；與siNC 組相比，siMETTL7B 組的克隆細胞數(shù)明顯減少（P＝0.001）。

CCK-8 法檢測結(jié)果（圖4B）顯示，72 h 時siNC 組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的D值分別0.52±0.08 和0.28±0.07，96 h 時siNC組 和siMETTL7B 組SK-NEP-1細胞的D值分別0.74±0.09 和0.39±0.07；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的增殖能力受到明顯抑制（P均＜0.001）。

FCM 法檢測結(jié)果（圖4C）顯示，siNC 組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的凋亡率分別為（9.80±3.11）%和（21.25±5.34）%；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的凋亡率明顯升高（P＝0.006）。

Transwell 小室法檢測結(jié)果（圖4D）顯示，siNC 組和siMETTL7B 組發(fā)生侵襲的SK-NEP-1細胞數(shù)分別為（312.90±78.89）個和（198.70±50.23）個；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SKNEP-1 細胞的侵襲能力受到明顯抑制（P＝0.013）。

細胞劃痕實驗檢測結(jié)果（圖4E）顯示，siNC組和siMETTL7B 組SK-NEP-1 細胞的劃痕愈合率遷移率分別為（39.23±12.10）%和（19.34±7.11）%；與siNC 組相比，siMETTL7B 組SKNEP-1 細胞的遷移能力受到明顯抑制（P＝0.030）。

Fig.4 Effects of silencing methyltransferase-like 7B (METTL7B) gene on proliferation,apoptosis,invasion and migration of SK-NEP-1 cells.A: The proliferation of SK-NEP-1 cells was detected by clone formation experiment.B: The proliferation of SK-NEP-1 cells was detected by CCK-8 method.C: The apoptotic rate of SK-NEP-1 cells was detected by flow cytometry (FCM) method.D: The invasion ability of SK-NEP-1 cells was detected by Transwell assay.E: The migration ability of SK-NEP-1 cells was detected by scratch healing experiment.siMETTL7B group: SK-NEP-1 cells were transfected with siMETTL7B targeting METTL7B gene;siNC group: SK-NEP-1 cells were transfected with siRNA negative control (NC)as the control.*P＜0.05,vs siNC group (n=3).圖4 沉默METTL7B 基因表達對SK-NEP-1 細胞增殖（A 和B）、凋亡（C）、侵襲（D）和遷移（E）的影響

3 討論

腎母細胞瘤是兒童常見的實體腫瘤之一，嚴重威脅患兒的生命健康。近年來，隨著手術(shù)及放化療技術(shù)的發(fā)展，腎母細胞瘤的預(yù)后已得到明顯改善[11]。然而，侵襲性生長和遠處轉(zhuǎn)移仍然是影響腎母細胞瘤預(yù)后的主要因素，因此有必要對其機制進行深入探討。

METTL7B 是甲基轉(zhuǎn)移酶樣家族成員之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶樣家族成員具有多種生物學(xué)功能，例如METTL3、METTL16、METTL2B 和METTL8 屬 于RNA 甲基轉(zhuǎn) 移酶，其在結(jié)直腸癌和肝細胞癌等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12-15]。METTL7B 屬于高爾基體相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶[6]，可能在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，然而既往相關(guān)報道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，METTL7B 能夠通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，進而增強甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[4]。LIU 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，METTL7B 可以調(diào)控非小細胞肺癌的細胞周期，沉默METTL7B基因表達可誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生G0/G1期停滯。對乳腺癌的研究也發(fā)現(xiàn)，METTL7B 可作為RhoBTB1的靶分子，在乳腺癌細胞的增殖和侵襲中發(fā)揮作用[5]。

當前，有關(guān)METTL7B 在腎母細胞瘤中的表達及其機制的研究尚鮮有報道。本研究首先檢測了72 例腎母細胞瘤組織及其配對的癌旁正常腎組織中METTL7B 的表達情況，結(jié)果顯示腎母細胞瘤組織中METTL7B 的陽性表達率高達68.06%（49/72），高于癌旁正常腎組織中的16.67%（12/72）。此外，與人腎母細胞瘤SK-NEP-1 細胞相比，正常腎上皮細胞PCS-400-010、PCS-400-011 和PCS-400-012 中METTL7B 蛋白的表達水平均明顯偏低，說明METTL7B可能作為癌基因在腎母細胞瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。與腎母細胞瘤預(yù)后相關(guān)的因素包括年齡、腫瘤分期、病理類型和腫瘤大小等[16-18]。本研究結(jié)果顯示，METTL7B 與腎母細胞瘤COG 分期和不良預(yù)后相關(guān)，說明METTL7B 可能參與腎母細胞瘤的惡性進展。腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡與腫瘤惡性進展密切相關(guān)[19-20]。為進一步明確METTL7B 在腎母細胞瘤中的作用，本研究采用小RNA 干擾技術(shù)靶向沉默METTL7B基因的表達，結(jié)果顯示沉默METTL7B 表達后SK-NEP-1細胞的增殖、侵襲和遷移能力均明顯受到抑制，而細胞凋亡率增加。

綜上所述，METTL7B 在腎母細胞瘤組織和細胞中高表達，METTL7B 與腎母細胞瘤COG分期和不良預(yù)后相關(guān)。沉默METTL7B 表達可能會抑制腎母細胞瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進其凋亡。本研究也存在一些局限，例如未檢測METTL7B 下游指標的變化，未分析METTL7B 對腎母細胞瘤細胞細胞周期的影響，未檢測METTL7B 在腎母細胞瘤患兒血清中的表達情況。因此，有待進一步研究METTL7B 在腎母細胞瘤早期診斷中的價值?？傊?，METTL7B可能會成為腎母細胞瘤的分子生物學(xué)標志物，未來需要對其生物學(xué)機制進行深入探討。