李俊杰，鄔海峰，張東明，張志平，陸赪陽，劉 波，李明章

膽囊癌起源于膽囊上皮細(xì)胞，是膽道系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤[1]。由于膽囊癌早期缺乏明顯的癥狀和體征，并且早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此大多數(shù)患者在確診時已處于中晚期或不可治愈階段，錯過了最佳的早期治療時機(jī)[2]。此外，膽囊癌對化療不敏感，并且現(xiàn)階段仍缺乏有效的靶向治療和免疫治療手段，而根治性手術(shù)切除是目前唯一有效的治療方法。最新研究指出，2003—2015年膽囊癌5 年生存率持續(xù)下降，平均生存時間為5.2～24.4 個月[3-4]。因此，尋找有效且不良反應(yīng)較小的抗膽囊癌藥物對于膽囊癌的治療以及改善膽囊癌患者的生活質(zhì)量具有十分重要的意義。

大蒜素（allicin）是天然植物大蒜鱗莖的提取物，具有抗氧化、抗炎、抗細(xì)菌、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)和心血管保護(hù)等功能[5]。現(xiàn)有研究已表明，大蒜素對原發(fā)性惡心腫瘤如胃癌、肝癌、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌等均具有抑癌作用[6-10]。國內(nèi)已有研究報道大蒜素能夠抑制人膽管癌細(xì)胞的增殖[11]，但尚未見有關(guān)大蒜素對膽囊癌細(xì)胞抑制作用的研究。本實驗旨在檢測大蒜素對膽囊癌細(xì)胞的增殖和侵襲是否具有抑制作用以及是否可以誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞的凋亡，并且探討其機(jī)制，以期為膽囊癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

膽囊癌細(xì)胞株NOZ 購于日本大阪健康科學(xué)研究資源庫。胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗混合液購于美國Gibco 公司?？讖綖? μm 的聚酯透明膜Transwell 小室購于美國Corning 公司。William 細(xì)胞培養(yǎng)液購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。CCK-8 細(xì)胞計數(shù)試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的Annexin Ⅴ（AnnexinⅤ-FITC）/ 碘化丙 啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗人剪切型-聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（cleaved-polyadenosine diphosphate ribose polymerase，cleaved-PARP）、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bcl-2、Bax、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）和GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

酶聯(lián)免疫檢測儀為美國Molecular Devices 公司產(chǎn)品，倒置熒光顯微鏡為德國Leica 公司產(chǎn)品，-80 ℃超低溫冰箱為日本三洋公司產(chǎn)品，化學(xué)發(fā)光儀為美國通用電氣公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀（Cyto FLEX）為美國貝克曼公司產(chǎn)品，SDS-PAGE 蛋白電泳儀和Bio-Rad 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀均為伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

NOZ 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素混合液的William 全培養(yǎng)液中，并置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度為70%～80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8 法檢測NOZ 細(xì)胞的增殖能力

將對數(shù)生長期的NOZ 細(xì)胞以2×103個/孔的密度接種于96 孔板中。培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞貼壁后，將完全培養(yǎng)液更換為含有不同終質(zhì)量濃度大蒜素（0、30、60、90 和120 μg/mL）的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24、48 和72 h，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，其中0 μg/mL 大蒜素組的NOZ 細(xì)胞僅用DMSO處理。加入CCK-8 試劑（10 μL/孔）避光繼續(xù)孵育2 h，然后在酶聯(lián)免疫檢測儀波長450 nm 處檢測各孔細(xì)胞D值，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（%）-（藥物組D值-空白對照組D值）/（對照組D值-空白對照組D值）×100%。采用Graphpad Prism 7 統(tǒng)計學(xué)軟件計算大蒜素對NOZ細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50），然后根據(jù)IC50值設(shè)置后續(xù)研究的藥物濃度。

1.2.3 平板克隆形成實驗檢測NOZ 細(xì)胞的克隆形成和增殖能力

收集經(jīng)不同質(zhì)量濃度大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）處理48 h 后的NOZ 細(xì)胞，以500個/孔的密度接種于6 孔板中。每3 d 更換1 次完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)15 d 后，除去培養(yǎng)液；用PBS溶液緩慢沖洗細(xì)胞2 次，加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min 后，用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。用清水緩慢沖洗掉殘余染料，在室溫下晾干，計數(shù)拍照。在光學(xué)顯微鏡下觀察NOZ 細(xì)胞的克隆形成情況，計數(shù)＞30 個細(xì)胞的集落數(shù)量。

1.2.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙 染FCM 法檢測NOZ 細(xì)胞凋亡率

NOZ 細(xì)胞的分組與處理方法同1.2.3 節(jié)。收集貼壁和懸浮的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 溶液沖洗細(xì)胞2 次后，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入Annexin Ⅴ-FITC 和PI（具體劑量參閱試劑盒操作說明書），室溫下避光孵育20 min，置于冰盒中，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Hoechst 33342 染色法檢測NOZ 細(xì)胞凋亡情況

取對數(shù)生長期的NOZ 細(xì)胞，接種于6 孔板中，孵育12 h 待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）繼續(xù)處理48 h。收集細(xì)胞加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，用PBS 溶液清洗細(xì)胞2 次，加入Hoechst 33342染色液，避光染色5 min。在熒光顯微鏡下觀察NOZ 細(xì)胞的細(xì)胞核染色情況，計算核凋亡細(xì)胞所占百分比。

1.2.6 FCM 法檢測NOZ 細(xì)胞周期分布的變化

收集經(jīng)不同質(zhì)量濃度大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）處理48 h 后的NOZ 細(xì)胞，用冰浴預(yù)冷的PBS 溶液洗滌，加入70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞2 h 后，再次用預(yù)冷的PBS 溶液洗滌；收集NOZ 細(xì)胞，加入預(yù)先配制的PI 染色液，37 ℃避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.2.7 Transwell 小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

將鋪設(shè)有基質(zhì)膠（matrigel）的Transwell 小室放入已加入600 μL 無血清培養(yǎng)液的24 孔板中，將小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中水化2 h。收集NOZ 細(xì)胞（細(xì)胞的分組與處理同1.2.3 節(jié)），以2×104個/孔的密度接種于200 μL 無血清的培養(yǎng)液中，并且置于Transwell 小室的上層；在小室下層加入600 μL 含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液作為趨化劑；24 h 后加入90%甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，隨后用棉簽拭去小室上層未穿過小室膜的細(xì)胞；用結(jié)晶紫染色液染色15 min，清水緩慢清洗掉殘余染料；在室溫下晾干小室膜后，在光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為100 倍）觀察NOZ 細(xì)胞的形態(tài)，拍照計數(shù)。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化

用不同質(zhì)量濃度的大蒜素處理NOZ 細(xì)胞（細(xì)胞的分組與處理同1.2.3 節(jié)），48 h 后收集細(xì)胞。用RIPA 蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，隨后用BCA 定量法計算蛋白質(zhì)濃度。取20 μg/孔的蛋白樣品，上樣行10% SDS-PAGE 分離蛋白；采用濕轉(zhuǎn)法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉40 min 后，分別加入一抗[ 兔抗人cleaved-PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin、vimentin 和GAPDH（內(nèi)參蛋白）單克隆抗體（體積稀釋比例均為1 ∶1 000）]4 ℃孵育過夜，隨后用TBST 溶液搖床清洗3 次，10 min/次；加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例均為1 ∶1 000）]室溫孵育1 h 后，用TBST 溶液再次清洗3 次。采用電化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光后，檢測蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參照GAPDH 蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗均獨立重復(fù)3 次，結(jié)果數(shù)據(jù)以表示。2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組之間比較首先采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素抑制人膽囊癌NOZ 細(xì)胞的增殖能力

用不同質(zhì)量濃度的大蒜素（0、30、60、90和120 μg/mL）分別處 理NOZ 細(xì) 胞24、48 和72 h 后，采用CCK-8 法檢測NOZ 細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果（圖1A）顯示，隨著大蒜素濃度的增加和處理時間的延長，NOZ 細(xì)胞的存活率逐漸降低（P均＜0.01）。這一結(jié)果表明，大蒜素可有效地抑制NOZ 細(xì)胞的增殖能力。大蒜素處理48 h 時，對NOZ 細(xì)胞的IC50值為（77.93±2.16）μg/mL。因此，后續(xù)選擇大蒜素40 μg/mL 作為低濃度組，80 μg/mL 作為中濃度組，120 μg/mL 作為高濃度組。

平板克隆形成實驗結(jié)果（圖1B）顯示，與對照組相比，隨著大蒜素濃度的增加，NOZ 細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯減少（P均＜0.001）。

上述結(jié)果說明，大蒜素可抑制膽囊癌NOZ細(xì)胞的增殖。

2.2 大蒜素促進(jìn)人膽囊癌NOZ 細(xì)胞凋亡

FCM 法檢測結(jié)果（圖2A）顯示，用不同質(zhì)量濃度的大蒜素（0、40、80 和120 μg/mL）作用NOZ 細(xì)胞48 h 后，NOZ 細(xì)胞的存活率分別為（85.62±2.051）%、（73.57±3.468）%、（44.83±2.792）% 和（40.09±1.725）%，提示隨著大蒜素濃度的增加，NOZ 細(xì)胞的存活率逐漸降低（P均＜0.01），而凋亡率（早期凋亡率與晚期凋亡率之和）逐漸升高（P均＜0.01）。

Hoechst 33342 染色法檢測NOZ 細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果（圖2B）顯示，用不同質(zhì)量濃度的大蒜素（40、80 和120 μg/mL）作用NOZ 細(xì)胞48 h后，核凋亡細(xì)胞所占百分比分別為（6.69±1.13）%、（12.79±1.36）%和（38.21±2.80）%，細(xì)胞核發(fā)生固縮和碎裂的數(shù)量明顯增加，與對照組[（2.08±0.70）%] 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

Fig.1 The proliferation of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) was detected by CCK-8 assay (A) and colony-formation assay (B).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖1 分別采用CCK-8 法（A）和平板克隆形成實驗（B）檢測不同濃度大蒜素對NOZ 細(xì)胞增殖能力的影響

蛋白印跡法檢測結(jié)果（圖2C）顯示，與對照組相比，大蒜素可上調(diào)促凋亡蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 9 和Bax的表達(dá)水平（P均＜0.001），并且當(dāng)大蒜素濃度為80 和120 μg/mL 時，可下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平（P＜0.001）。

上述結(jié)果均表明，大蒜素具有促進(jìn)膽囊癌NOZ 細(xì)胞凋亡的作用。

2.3 大蒜素可將NOZ 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期

采用FCM 法檢測大蒜素對NOZ 細(xì)胞周期的影響。FCM 法檢測結(jié)果顯示（圖3A），隨著大蒜素質(zhì)量濃度的逐漸增高（40、80 和120 μg/mL），在G2/M 期細(xì)胞所占的百分比分別為（19.98±1.50）%、（30.13±1.44）% 和（37.52±0.96）%，與對照組的（9.07±1.27）%相比，分布于G2/M 期細(xì)胞所占的百分比明顯提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖3B）顯示，與對照組相比，G2/M 期進(jìn)展相關(guān)調(diào)節(jié)分子蛋白CDK1 和cyclin B1 的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P均＜0.05）。

2.4 大蒜素抑制NOZ 細(xì)胞的侵襲能力

Transwell 小室實驗檢測結(jié)果顯示（圖4A），隨著大蒜素質(zhì)量濃度的增加（40、80 和120 μg/mL），NOZ 細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)分別為（306.30±28.73）個，（112.00±9.85）個 和（30.00±3.61）個，與對照組[（933.3±41.57）個]相比，穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。

Fig.2 The apoptosis of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) for 48 h was detected by flow cytometry (FCM) method (A) and Hoechst 33342,as well as the expression levels of apoptosis-related proteins cleaved-polyadenosine diphosphate ribose polymerase (cleaved-PARP),cleaved-caspase 3,cleaved-caspase 9,Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting (C).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖2 分別采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染法（A）和Hoechst 33342 染色法（B）檢測不同濃度的大蒜素作用48 h 后對膽囊癌NOZ 細(xì)胞凋亡的影響及蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（C）

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖4B）顯示，經(jīng)大蒜素處理后，NOZ 細(xì)胞中的侵襲抑制蛋白E-cadherin 的表達(dá)水平明顯升高，而促運動及侵襲蛋白N-cadherin 和vimentin 的表達(dá)水平明顯降低且呈劑量依賴效應(yīng)（P均＜0.001）。

Fig.3 The cell cycle distribution of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) for 48 h was detected by flow cytometry (FCM) method(A),and the expression levels of cell cycle-related proteins cyclin B1 and cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)were detected by Western blotting (B).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖3 FMC 法檢測不同濃度大蒜素對NOZ 細(xì)胞周期分布的影響（A），蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平（B）

Fig.4 The invasion ability of human gallbladder carcinoma NOZ cells treated with different concentrations of allicin (40,80 and 120 μg/mL) for 48 h was detected by Transwell camber assay (A,crystal violet staining,×100),and the expression levels of invasion-related proteins E-cadherin,N-cadherin and vimentin were detected by Western blotting (B).NOZ cells treated with DMSO were taken as the control.***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖4 Transwell 小室實驗檢測大蒜素對NOZ 細(xì)胞侵襲能力的影響（A），蛋白質(zhì)印跡法檢測侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化（B）

3 討論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其5年生存率僅為5%[12]。因此，新藥研發(fā)對于膽囊癌的治療具有重要意義。大蒜素為天然植物大蒜鱗莖的提取物，相關(guān)研究證明其對多種原發(fā)性腫瘤具有抑制作用。然而，有關(guān)大蒜素是否對膽囊癌亦具有抑制作用，尚未見相關(guān)報道。本研究旨在探討大蒜素對膽囊癌NOZ 細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制。

本研究中，CCK-8 法和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，大蒜素可有效抑制膽囊癌NOZ 細(xì)胞的增殖能力。眾所周知，細(xì)胞凋亡是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的重要途徑[13]。凋亡細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞核固縮、碎裂和溶解等一系列特殊的形態(tài)學(xué)變化[14]。本研究采用Annexin-V-FITC/PI 雙染法和Hoehst 33342 染色法檢測經(jīng)大蒜素處理后NOZ 細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加，細(xì)胞核固縮和碎裂的比例也隨大蒜素濃度的增加而逐漸升高，由此說明大蒜素可以促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的凋亡。凋亡信號級聯(lián)傳導(dǎo)可通過死亡受體外途徑和線粒體凋亡介導(dǎo)內(nèi)途徑發(fā)生[15]。定位于線粒體上的Bcl-2 家族蛋白包括促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，可調(diào)控線粒體中細(xì)胞色素的釋放，從而激活caspase 級聯(lián)產(chǎn)物及特定底物引起細(xì)胞發(fā)生凋亡[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可明顯上調(diào)Bax 的表達(dá)水平，同時降低Bcl-2 的表達(dá)水平，并且明顯上調(diào)促凋亡蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9 的表達(dá)水平，說明大蒜素可能通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)膽囊癌NOZ 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

由于腫瘤細(xì)胞具有快速增殖的特點，因此本研究檢測了大蒜素對膽囊癌NOZ 細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。FCM 法檢測結(jié)果顯示，大蒜素可以將NOZ 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期。此外，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示，CDK1 和cyclin B1 的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而這2 種蛋白均是與G2/M 期進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵蛋白[19]。

本研究采用Transwell 小室實驗證實大蒜素可以抑制NOZ 細(xì)胞的侵襲能力。E-cadherin 在維持細(xì)胞形態(tài)以及黏附系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)黏附蛋白表達(dá)水平降低時，細(xì)胞的侵襲和遷移能力均明顯增強[20]。N-cadherin 是非上皮性鈣黏附蛋白之一，可以促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，其表達(dá)水平上調(diào)可增強細(xì)胞的侵襲能力[21]。Vimentin 的過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強以及不良預(yù)后均密切相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可明顯上調(diào)E-cadherin 的表達(dá)水平，從而增加細(xì)胞之間的黏附性，同時通過下調(diào)N-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)水平，從而降低NOZ 細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，本研究結(jié)果提示大蒜素可明顯抑制膽囊癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并且促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究為大蒜素作為膽囊癌的潛在治療藥物提供了實驗依據(jù)。本研究的不足之處在于僅進(jìn)行了體外實驗，今后將開展體內(nèi)實驗以進(jìn)一步研究大蒜素對膽囊癌的作用及其機(jī)制。