(四川威斯特分析測試有限公司，四川成都 610101)

川法小曲白酒釀造歷史悠久、風格典型、味道獨特，是清香型白酒工藝的代表之一。川法小曲白酒生產(chǎn)所用的原料品種范圍廣，如高粱、玉米、稻谷、大麥、小麥等，其中以高粱、玉米和稻谷居多，原因在于高粱獨有的單寧物質(zhì)令酒更芳香濃郁、玉米發(fā)酵生成甘油使酒質(zhì)甘甜、大米脂肪纖維少利于緩慢發(fā)酵使酒體凈爽、醇厚[1]。小曲在釀造川法小曲白酒過程中是重要的糖化發(fā)酵劑，這一作用主要依賴于其含有豐富的微生物群落，如酵母菌、霉菌、細菌等，其中起主要作用的是酵母菌和霉菌。目前，川法小曲白酒廠使用的小曲品牌不一，不同小曲的微生物群落結(jié)構(gòu)也各不相同，使得釀出的小曲酒風格各異[2]。

固相微萃?。⊿PME）技術于1990 年開發(fā)，現(xiàn)已被廣泛應用于食品的風味物質(zhì)研究[3]，具有操作時間短、樣品用量少、快速、易于使用、無需溶劑、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。Fan[4]通過HS-SPME-GC-MS 技術分析洋河大曲的原酒、年份酒的香氣成分，結(jié)果顯示，酯類是洋河大曲酒的主要香氣成分，己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯在原酒和年份酒中都有非常高的閾值。Butkhup[5]利用HS-SPME-GC-MS 技術定性分離桑葚果酒的揮發(fā)性成分，成功檢測到80 種揮發(fā)性成分，主要為醇類、酯類等。Jurado[6]利用HSSPME-GC和化學統(tǒng)計學分析幾種品牌的西班牙白酒，定量分析出乙酸乙酯濃度為55.86～125.27μg/mL，戊酸乙酯濃度為0.91～6.72 μg/mL，己酸乙酯濃度為0.09～0.81μg/mL。

本研究采用HS-SPME-GC-MS 技術，試圖探討原料及小曲對釀造川法小曲白酒特性的影響，有利于利用糧食間營養(yǎng)互補、作用互補，開發(fā)多糧川法小曲白酒，為豐富味覺提供較為全面的物質(zhì)基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗選用東北紅高粱、四川玉米、四川稻谷為發(fā)酵原料谷物，以四川華西牌小曲(曲1，成都彭州市華西酒曲廠)、四川大竹小曲（曲2，四川大竹酒曲廠）、湖北小曲（曲3，湖北省秭歸縣屈香醇酒曲坊）為糖化發(fā)酵劑，實驗室4 ℃冰箱中保存。

1.2 實驗設計

實驗是探討原料與小曲兩單因素對釀造川法小曲白酒中酒體的風味成分及感官的影響。以3種原料針對3 種曲進行9 次雙因素交互試驗，具體實驗組合用A、B、C 3個代碼進行表示，整體實驗重復1次，實驗設計見表1。

表1 實驗設計表

1.3 生產(chǎn)工藝

傳統(tǒng)小曲白酒的生產(chǎn)工藝流程[7]為將原料先后經(jīng)過浸泡（原料放入恒溫水中浸泡，稻谷、高粱50 ℃，玉米60 ℃，使原料充分吸水）、蒸糧（高溫蒸煮原料使其糊化，初蒸即第一次蒸糧，燜水即初蒸后的原料放入40～50 ℃的溫水中通過熱脹冷縮使其破裂，復蒸是再一次的蒸糧糊化）、拌曲培菌（接種小曲，微生物生長產(chǎn)酶）、配糟發(fā)酵（糟醅是蒸餾出酒后留下的原料），最終蒸餾得到川法小曲白酒。整個發(fā)酵過程采用恒溫培養(yǎng)箱控溫發(fā)酵，控溫數(shù)據(jù)來源于生產(chǎn)實際發(fā)酵溫度。

1.4 感官評價分析

酒體的感官評價是用來衡量酒質(zhì)的參考標準之一。參考國家清香型白酒標準GB/T 10781.2—2006 和貴州省地方小曲清香型白酒標準DB S52/005—2014 制定出川法小曲白酒的感官評價體系，包括5 個指標：色澤、香氣、口味、風格和飲后感受。根據(jù)特爾菲法確定5 個權(quán)重分別為0.1、0.25、0.4、0.15、0.1[8]。10 位專業(yè)品酒人員為樣品的5 個指標依次打分，然后計算出5 個指標的算術平均值，最后再通過加權(quán)計算確定該樣品的綜合成績。

1.5 HS-SPME-GC-MS定性定量分析

20 mL頂空瓶中加入9 mL白酒樣品、1.8 g氯化鈉，置于50 ℃恒溫水中平衡30 min，然后將已經(jīng)老化好的萃取頭（50/30 μM DVB/CAR on PDMS，Supelco，美國，老化溫度230 ℃，初次使用老化30 min）插入頂空瓶，置于頂空瓶上空萃取45 min，萃取頭距離液面1 cm，最后將萃取頭手動進樣于GC-MS上，色譜分析[9]。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀采用DB-WAX 毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm，安捷倫，美國），進樣口溫度250 ℃，柱箱升溫程序：35 ℃保持5 min，然后以5 ℃/min 升至100 ℃，保持2 min，最后以15 ℃/min升至230 ℃，保持10 min，運行時間39 min[10]。載氣：99.999%，高純度氦氣載氣流速：1 mL/min。質(zhì)譜條件：EI 離子源，離子源溫度為230 ℃，電離電壓為70 eV，接口溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，電離方式：EI，質(zhì)量掃描范圍為m/z 30～500；譜庫：NIST05a.L。香氣物質(zhì)的定性：與NIST05a.L 譜庫進行比對分析定性[5]。

采用外標法定量[11]，標準濃度梯度的混合樣品依次進樣，得到線性方程。將同一樣品進行3 次重復試驗，計算RSD 值驗證方法的穩(wěn)定性。采用樣品加標實驗計算樣品回收率[12]，驗證方法的可行性。每個樣品3次重復試驗，準確定量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

運用Excel 2013 軟件進行雙因素交叉重復實驗方差分析，比較各因素及各因素之間的交互作用對結(jié)果的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價結(jié)果

釀酒原料、釀造用水、釀造用曲、釀造工藝及白酒陳化等是影響白酒質(zhì)量的基本原因，也是影響其感官的重要因素。本研究主要以釀酒原料、釀造小曲兩因素進行實驗，蒸餾得到的小曲酒樣品感官評價結(jié)果如圖1 所示。從最終感官得分上看各酒樣相差不大，尤其是色澤、風格、香氣風味基本相同，在口感及飲后感受稍有差別。最終感官評價得分相對較低，歸結(jié)于實驗室釀造規(guī)模小，環(huán)境因素影響大，但是數(shù)據(jù)的結(jié)果（方差分析）仍然可以說明原料及小曲對川法小曲白酒品質(zhì)影響的差異性。

圖1 感官評價結(jié)果

2.2 方差分析

圖2 為酒樣原料出酒率與總酯含量結(jié)果圖，橫坐標為樣品，左縱坐標為原料出酒率（柱狀圖），右縱坐標為總酯含量（散點圖）。從圖2 可以看出，A與B 的原料出酒率相差不大，C 明顯高于前兩者?？傰ズ糠矫?，A、B 高于C，但直觀上不明顯。為了進一步揭示原料與小曲對結(jié)果的顯著性，對感官評價、出酒率及總酯含量3 個方面進行方差分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2。

圖2 原料出酒率及總酯含量結(jié)果

從表2 可看出，樣本代表的是原料，列代表的是小曲，交互表示的是兩因素的交互作用，內(nèi)部表示的是誤差。根據(jù)P-value≤0.01，可判斷因素對分析結(jié)果有非常顯著（**）的影響，0.01＜P-value≤0.05，可判斷因素對分析結(jié)果影響顯著（*），P-value＞0.05，可判斷因素對分析結(jié)果影響不顯著。

表2 方差分析結(jié)果

對于原料出酒率的方差分析結(jié)果，P-value=7.74E-08＜0.01，表明樣本對分析結(jié)果有非常顯著（**）的影響，即原料對川法小曲白酒出酒率有非常顯著的影響。P-value=0.078731＞0.05，表明小曲對分析結(jié)果影響不顯著，即小曲對川法小曲白酒出酒率影響不顯著。P-value=0.064233＞0.05，表明原料和小曲的交互作用對試驗結(jié)果的影響不顯著，原料和小曲的交互作用對川法小曲白酒出酒率影響不顯著。出酒率主要受原料的影響，根霉微生物產(chǎn)酶的糖化程度主要是針對原料淀粉的利用率，從而影響酵母的產(chǎn)酒。

對于總酯的方差分析結(jié)果，P-value=3.11E-05，7.7E-06，0.000243均小于0.1，所以，樣本、列及交互對方差分析的結(jié)果有非常顯著的影響，即原料、小曲及兩種的交互對川法小曲白酒中總酯的形成有非常顯著的影響。川法小曲白酒中的酯類對川法小曲白酒風味的貢獻特別大，表明原料、小曲共同作用于川法小曲白酒風味物質(zhì)的代謝。

對于感官評價的方差分析結(jié)果，P-value=0.038842＜0.05，可以得出樣本對方差分析實驗結(jié)果有顯著影響，即原料對川法小曲白酒品質(zhì)的感官方面有顯著影響。P-value=0.113886，0.196312 均大于0.05，表面列、交互對實驗結(jié)果不顯著，即小曲、原料與小曲之間的交互對川法小曲白酒品質(zhì)的感官方面影響不顯著。

2.3 HS-SPME-GC-MS定性定量分析

2.3.1 標準工作曲線的繪制

以5 個濃度梯度（a，b，c，d，e，由小至大）的混合標準溶液為橫坐標（x，單位為mg/100 mL），標準溶液的峰面積為縱坐標（y,豐度），繪制外標法標準曲線，得到濃度梯度的色譜離子圖（以濃度e 為例，見圖3）和各成分的線性方程表（表3）。從圖3和表3 中可以看出，各揮發(fā)性成分的分離效果良好，揮發(fā)性成分出現(xiàn)的次序從左至右依次為：乙醛、乙酸乙酯、乙縮醛、仲丁醇、正丙醇、異丁醇、異戊酸乙酯、正丁醇、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、正己醇、糠醛、苯甲醛、β-苯乙醇，且在測定的線性范圍內(nèi)線性相關系數(shù)均大于0.99，足以滿足樣品的定量分析。

2.3.2 方法的穩(wěn)定性實驗

樣品A1 連續(xù)進樣3 次，考察樣品的RSD 值，結(jié)果如表4 所示，各組分的RSD 值均小于5 %，表明穩(wěn)定性較好，實驗方法可靠。

2.3.3 樣品回收率實驗

圖3 混合標準溶液的離子圖（以濃度e為例）

表3 各成分線性方程范圍及其相關系數(shù)

表4 穩(wěn)定性實驗RSD值

將2 份加標處理的白酒樣品A1 和2 份不加標處理的樣品A1 按相同的條件處理進樣分析，將分析得到的峰面積代入表中得到的線性方程并計算樣品的回收率。各組分平均回收率在85 %～130%之間，滿足定量分析的要求(表5)。

2.3.4 定性結(jié)果分析

采用HS-SPME-GC-MS 從9 個樣品中共檢測出46種揮發(fā)性成分（表6），揮發(fā)性成分包括酯類15種、醇類10 種、醛酮類6 種、烷烴類5 種和其他10種。其中相對百分比含量較大的是乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇等揮發(fā)性成分。在市售川法小曲白酒的揮發(fā)性成分研究中發(fā)現(xiàn)，其主要成分包括乙酸乙酯、異戊醇、正丙醇、異丁醇等[13]，與本實驗所測的結(jié)論相符合，說明實驗室模擬發(fā)酵川法小曲白酒具有一定的可行性。

表5 回收率實驗及其回收率

9 個樣品中依次檢測出23 種、22 種、25 種、27種、20 種、25 種、24 種、27 種和22 種揮發(fā)性成分，其中共含有的揮發(fā)性成分為乙醛、乙酸乙酯、乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊酸乙酯、異戊醇、糠醛和苯乙醇9種。這幾種成分是大曲和麩曲清香型白酒中存在的揮發(fā)性成分，其中乙酸乙酯、異戊醇和苯乙醇是揮發(fā)性成分中重要的特征組成成分之一[4]。

表6 樣品的揮發(fā)性成分及相對百分比含量(%)

表7 樣品的揮發(fā)性成分定量結(jié)果

高粱小曲酒樣品（A1、A2、A3）揮發(fā)性成分中，共含有17 種相同成分，其中以乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、2-甲基丁醇和異戊醇相對百分比含量較高。玉米小曲酒樣品（B1、B2、B3）揮發(fā)性成分中，共含有15 種相同成分，其中以乙酸乙酯、異丁醇和異戊醇相對百分比含量較高。稻谷小曲酒樣品（C1、C2、C3）揮發(fā)性成分中，共含有16 種相同成分，其中以乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇和苯乙醇相對百分比含量較高。研究發(fā)現(xiàn)，苯乙醇為米酒的特征香氣成分，在用稻米生產(chǎn)的酒精飲料中（黃酒、日本清酒、中國米酒等）特別容易出現(xiàn)[13]。

2.3.5 定量結(jié)果分析

表7 和表8 分別為15 種揮發(fā)性成分的定量結(jié)果（丁酸乙酯未檢測到）及川法小曲白酒微量成分的最佳含量范圍，從表7 中可看出，高粱小曲酒(A1、A2、A3)樣品中乙酸乙酯的含量（178.95 mg/100 mL、192.24 mg/100 mL、177.99 mg/100 mL）高于玉米小曲酒（B1、B2、B3）和稻谷小曲酒（C1、C2、C3）樣品，玉米小曲酒異戊醇的含量（182.82 mg/100 mL、122.58 mg/100 mL、185.73 mg/100 mL）明顯高于高粱、稻谷小曲酒，稻谷小曲酒中苯乙醇的含量（24.13mg/100mL、16.313mg/100mL、14.57mg/100mL）也明顯高于高粱和玉米小曲酒。其他揮發(fā)性成分在各樣品中的濃度都相差不大。由表7和表8可以看出，乳酸乙酯的含量均在20～200 mg/100 mL最佳范圍內(nèi)，乙酸乙酯的最佳濃度范圍為180～200 mg/100 mL，只有高粱小曲酒比較接近，玉米和稻谷小曲酒的乙酸乙酯濃度稍微偏低。在豐谷和劍南春濃香型白酒中己酸乙酯的濃度分別高達232.6 mg/100 mL 和273 mg/100 mL，而在小曲清香型白酒中己酸乙酯不是主要的揮發(fā)性成分，含量相對較?。ǘ荚? mg/100 mL左右），本實驗所測到的己酸乙酯的濃度也低于川法小曲白酒中己酸乙酯的最佳濃度范圍1～5 mg/100 mL。異戊酸乙酯、正丙醇均在最佳范圍內(nèi)(0～4 mg/100 mL、20～40 mg/100 mL)，異丁醇的含量稍微大于30～60 mg/100 mL 這個范圍。玉米小曲酒中異戊醇含量遠高于最佳范圍（50～100 mg/100 mL），高粱和稻谷小曲酒符合最佳濃度范圍。除了稻谷小曲酒中苯乙醇高于最佳范圍外（1～4 mg/100 mL），高粱和玉米小曲酒都在其范圍左右。其余成分基本位于最佳范圍內(nèi)。

表8 清香型川法小曲白酒的微量成分含量

3 結(jié)論

不同原料和小曲的兩因素交互實驗結(jié)果表明，原料對出酒率、酒體總酯含量及感官評價有非常顯著的影響，小曲及小曲與原料的交互對酒體總酯含量有非常顯著的影響。HS-SPME-GCMS 分析結(jié)果顯示，酒體共檢測出46 種揮發(fā)性成分，包括酯類15 種、醇類10 種、醛酮類6 種、烷烴類5 種以及其他10 種，其中相對百分比含量較高的是乙酸乙酯、異丁醇、異戊醇等。定量方法顯示標準曲線線性良好，R2＞0.99。穩(wěn)定性試驗顯示出RSD＜5%，回收率實驗顯示回收率在85%～130%之間，表明方法可靠，適合樣品定量分析。定量結(jié)果顯示出高粱小曲酒乙酸乙酯濃度最高達192.2358 mg/100 mL，玉米小曲酒異戊醇濃度最高達到185.7310 mg/100 mL。稻谷小曲酒中乙酸乙酯濃度最高達176.2874 mg/100 mL，但其β-苯乙醇的濃度遠高于高粱、玉米小曲酒為24.1257 mg/100 mL。定量到的揮發(fā)性成分基本位于川法小曲白酒中微量成分的最佳濃度范圍。原料及小曲對川法小曲白酒釀造特性的影響對混糧生產(chǎn)川法小曲白酒及改善川法小曲白酒品質(zhì)奠定基礎，也對川法小曲白酒中重要風味物質(zhì)的代謝提供參考。