王夢潔，儲天琪，劉峰，詹煒，樓寶，徐萬土

(1.浙江海洋大學 水產(chǎn)學院，浙江 舟山 316022；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院水生生物研究所，浙江 杭州 310021；3.象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司，浙江 寧波 315700)

1 引言

鹽度是影響水生生物生長、存活的重要環(huán)境因子[1]。受到人為或自然因素的影響，養(yǎng)殖區(qū)域鹽度會發(fā)生變化，對魚體產(chǎn)生一定的滲透調(diào)節(jié)脅迫，從而使魚體產(chǎn)生應激反應，這不僅會導致機體免疫力降低、滲透壓調(diào)控機制紊亂等生理變化，甚至可能出現(xiàn)死亡[2?3]。魚類通過引起非特異性免疫系統(tǒng)中抗氧化酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）活力的變化，來抵御鹽度的脅迫[4]。例如在長期低鹽或高鹽度脅迫下，抗氧化酶可以清除體內(nèi)由于應激反應產(chǎn)生的過多的氧自由基（ROS），減輕氧化性的損傷，增強機體免疫功能[5]。磷酸酶參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝,能夠?qū)⒋x產(chǎn)物水解成磷酸和乙醇，其水解生成的小分子物質(zhì)將會被排出體外，最終完成水生生物機體去磷酸化過程。因此，一定程度上，非特異性免疫酶活力變化可以作為反映不同鹽度脅迫下魚體適應能力和免疫機能的生理指標。通常認為魚類存在一個等滲點，當鹽度超出等滲點時多數(shù)廣鹽性魚類會消耗能量來進行體內(nèi)離子含量調(diào)節(jié)，以維持自身內(nèi)部的水鹽平衡來適應鹽度大范圍的變化[6]，此為滲透壓調(diào)節(jié)過程。Na+/K+-ATP 酶與滲透壓調(diào)節(jié)密切相關(guān)，通過參與細胞內(nèi)Na+、K+離子的主動跨膜轉(zhuǎn)運，維持魚體內(nèi)外滲透壓平衡，因此可作為衡量魚類滲透壓調(diào)節(jié)主要指標[6?7]。目前，研究人員已對大麻哈魚（Oncorhynchus keta）[8]、克氏雙鋸魚（Amphiprion clarkii）[7]、銀鯧（Pampus argenteus）[9]、多鰭南極魚（Notothenia neglecta）[10]等水產(chǎn)動物進行了鹽度對其生理指標，包括抗氧化酶、非特異性免疫酶、Na+/K+-ATP 酶活力等的影響研究。對鹽度脅迫下魚體內(nèi)生理變化開展研究，有助于了解鹽度變化對魚體生理的影響，同時也為養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中改善水環(huán)境狀況、提高養(yǎng)殖效益提供了指導。

小黃魚（Larimichthys polyactis），隸屬于鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaenidae），黃魚屬（Larimichthys），廣泛分布于渤海、黃海、東海以及朝鮮半島西岸地區(qū)，晝夜棲息于近底層，為暖溫性近底層魚類[11]。受到自然環(huán)境與人為因素的影響，野生小黃魚資源利用程度明顯銳減，現(xiàn)今所捕到的漁獲物中以低齡為主[12]。因此，實施一系列保護和恢復漁業(yè)資源的項目，以此實現(xiàn)小黃魚資源可持續(xù)利用就顯得尤為重要[13?14]。隨著小黃魚人工規(guī)模化繁殖技術(shù)的突破[15]，通過人工增殖放流的方式助力小黃魚的資源恢復成為可能。同時以人工養(yǎng)殖品種代替捕撈小黃魚滿足消費者需求，可以極大程度降低小黃魚的捕撈壓力，促進小黃魚種質(zhì)資源的恢復。但在養(yǎng)殖過程中，夏季風暴雷雨頻發(fā)以及干旱、水體富營養(yǎng)化等問題的出現(xiàn)，導致近岸海水鹽度時有變化，對海水魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)生了很大的影響。因此養(yǎng)殖地區(qū)鹽度條件是開展養(yǎng)殖必需要考慮的一個重要因素。

本研究中，以小黃魚幼魚為實驗對象，在正常海水鹽度為22.1 的養(yǎng)殖條件下，直接轉(zhuǎn)入鹽度為5 的低鹽和鹽度為34.5 的高鹽條件下保持10 d，測定其肝臟中抗氧化酶（超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT））、磷酸酶（酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP））以及鰓、腎組織中Na+/K+-ATP 酶的活力水平，探討鹽度變化對肝臟中抗氧化酶、磷酸酶以及腎臟和鰓中的Na+/K+-ATP 酶活力的影響，闡明肝臟、腎臟和鰓在鹽度適應過程中發(fā)揮的作用，以期為開展人工海水養(yǎng)殖的水體鹽度調(diào)節(jié)、半咸水或淡化養(yǎng)殖提供理論依據(jù)，從而達到高效生產(chǎn)的目的。

2 材料與方法

2.1 實驗材料及實驗設計

實驗魚取自象山港灣水產(chǎn)苗種有限公司人工繁育的小黃魚群體，選取規(guī)格整齊，體質(zhì)健壯個體（體長為（11.8±0.9）cm；體質(zhì)量為（12.6±3.1）g），進行實驗。實驗開始前，實驗魚在2 500 L 的實驗桶中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖用水為經(jīng)黑暗沉淀、砂濾后的自然海水，溫度為（29.6±1）℃，鹽度為22.1，投喂魚寶稚魚3 號（粒徑為3 mm）顆粒飼料，每天7:00 和16:00 進行2 次飽食投喂，投喂后半小時進行換水排污處理。通過預實驗確定低鹽和高鹽脅迫所用鹽度。實驗設置3 個鹽度，分別為低鹽組（鹽度為5.0±0.3）、對照組（鹽度為22.1）和高鹽組（鹽度為34.5±0.4），每組設置3 個平行實驗。低鹽組通過添加曝氣后的淡水調(diào)配而成；高鹽組通過添加商品化海水晶調(diào)配而成。實驗開始前一天停止投喂飼料，將暫養(yǎng)后的實驗魚轉(zhuǎn)入調(diào)好鹽度的300 L 實驗桶中，每桶實驗魚40 尾。實驗期間，停止投喂餌料。

2.2 樣品的采集及酶活力的測定

實驗魚在鹽度處理10 d 后，每個平行隨機取樣5 尾，置于冰盤上冰凍處死后解剖，取肝臟、鰓和腎臟放入離心管中，液氮速凍后，置于?80℃保存。肝組織用于檢測非特異性免疫酶活力，包括SOD、CAT、ACP 和AKP，鰓和腎組織測定Na+/K+-ATP 酶活力。準確稱取0.2 g 組織重量，按重量體積比加入9 倍體積的生理鹽水制成10% 的組織勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清再用生理鹽水稀釋至測定所需濃度。蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法[2]，SOD 和CAT 的測定分別采用羥胺法、鉬酸銨法[16]，ACP 和AKP 的測定采用金氏法[16]；Na+/K+-ATP 酶的測定采用定磷法[17]。所有組織中的蛋白含量和酶活力的測定均采用南京建成公司檢測試劑盒，按照操作說明完成。

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果均用平均值±標準差（mean±SD）表示，利用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性分布與方差齊性檢驗后進行單因素方差分析（One-way ANOVA）、多重比較（Tukey）以及雙獨立樣本檢驗（Mann-Whitney U）。p＜0.05 為存在顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 小黃魚存活率

對小黃魚的鹽度耐受范圍進行預實驗，表1 為不同鹽度急性脅迫下24 h 內(nèi)小黃魚的存活情況。從表中可以看出，急性脅迫鹽度為3.9 時，小黃魚24 h 內(nèi)存活率為(71.0±2.57)%，10 d 內(nèi)存活率為0；小黃魚在急性脅迫鹽度為5.0 時成活率為100%，在實驗過程中極少數(shù)個體出現(xiàn)輕微異常。當急性脅迫鹽度在41.6～45.0之間時，小黃魚雖在1 h 內(nèi)均未出現(xiàn)個體死亡，但卻無法保持平衡，出現(xiàn)側(cè)翻、狂游現(xiàn)象，在3.5 h 內(nèi)全部鰓蓋擴張死亡。鹽度在36.0～40.0 時，6 h 以內(nèi)應激性死亡尾數(shù)超過一半，24 h 內(nèi)的存活率低于40.0%，在為期10 d 的高鹽脅迫中仍出現(xiàn)少數(shù)死亡，表現(xiàn)為體表發(fā)黏、變黑行動遲緩的現(xiàn)象。鹽度為34.5 時24 h 內(nèi)存活率為(91.0±2.35)%，10 d 內(nèi)存活率為(85.0±2.04)%。經(jīng)預實驗確定低鹽組鹽度為5.0，高鹽組鹽度為34.5進行急性鹽度脅迫實驗。

表1 不同鹽度脅迫下小黃魚的存活情況Table 1 Survival of L.polyactis under different salinity stress

3.2 小黃魚肝臟抗氧化酶活力

不同鹽度脅迫下小黃魚肝臟組織中抗氧化酶活力見圖1，從圖中可以看出，鹽度脅迫（高鹽、低鹽）下，小黃魚肝臟組織中SOD 活力與CAT 活力均有不同程度的升高。其中，低鹽組的SOD 活力為（517.37±1.56）U/mg，顯著高于對照組（p＜0.05），但是與高鹽組差異不顯著（p＞0.05）；CAT 活力與對照組無顯著性差異。高鹽組的CAT 活力最大，為（8.08±0.37）U/mg，顯著高于對照組（p＜0.05），但是與低鹽組差異不顯著（p＞0.05）。

3.3 小黃魚肝臟組織磷酸酶活力

圖2 為不同鹽度處理后ACP 和AKP 活力變化對比分析結(jié)果。其中，ACP 活力在高鹽組中顯著低于對照組和低鹽組（p＜0.05），而低鹽組與對照組之間差異不顯著（p＞0.05）。AKP 活力在高鹽組中最高，為（14.05±1.36）U/mg，顯著高于低鹽組（p＜0.05），但是與對照組差異不顯著（p＞0.05）。對比ACP 和AKP 發(fā)現(xiàn)，兩種酶活力在3 個處理組中的變化趨勢相反：前者逐漸降低，后者逐漸升高。

圖1 不同鹽度脅迫下小黃魚肝臟組織抗氧化酶活力Fig.1 Antioxidant enzyme activity in liver of L.polyactis under different salinity stress

圖2 不同鹽度脅迫下小黃魚肝臟組織磷酸酶活力Fig.2 Phosphatase activity in liver of L.polyactis under different salinity stress

3.4 小黃魚鰓和腎臟組織Na+/K+-ATP 酶活力

圖3 為不同鹽度條件下，小黃魚鰓和腎臟中Na+/K+-ATP 酶活力的分析結(jié)果。比較發(fā)現(xiàn)，低鹽組的鰓組織中Na+/K+-ATP 酶活力為（0.74±0.05）U/mg，顯著性低于對照組和高鹽組（p＜0.05），而高鹽組與對照組差異不顯著（p＞0.05）。此外，經(jīng)低鹽和高鹽處理后，腎臟組織中Na+/K+-ATP 酶活力均上升，且高鹽組與對照組差異顯著（p＜0.05）。

4 討論

4.1 鹽度脅迫對小黃魚存活率的影響

鹽度可影響魚類的攝食量、生長存活及免疫能力[18]。在高鹽脅迫過程中，小黃魚出現(xiàn)狂游及體表發(fā)黏、變深的現(xiàn)象。此現(xiàn)象與褐點石斑幼魚（Epinephelus fuscoguttatus）在高鹽（60、65）脅迫中的表現(xiàn)較為一致，即魚苗行為異常、體色變深、體表黏液變多[19]。在漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）的研究中發(fā)現(xiàn)，其在鹽度最低（0）和最高（40）的突變下，出現(xiàn)應激性上下竄動行為和體色變白的現(xiàn)象[20]。這些研究表明，水環(huán)境中鹽度的變化會引起魚類行為和體色方面的應激改變。不同鹽度下魚體內(nèi)滲透壓存在較大差異[21]，通常情況下，淡水魚和海水魚體液含鹽質(zhì)量分數(shù)相差約為7%[22]。滲透壓的調(diào)節(jié)不僅維持了滲透濃度的穩(wěn)定，也決定魚類機體對鹽度的適應能力。短期內(nèi)的鹽度劇烈變化會使魚體產(chǎn)生應激反應引起滲透調(diào)節(jié)機制的改變[23]，達到一定時間后，滲透壓逐漸向變化前恢復，維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而一旦超出其適應范圍則會出現(xiàn)生理狀態(tài)紊亂、行為異常及攝食量下降現(xiàn)象，最終消耗能量過多，機體衰竭，導致死亡[23-24]。本次研究中，低鹽組未出現(xiàn)死亡，說明該鹽度在小黃魚能夠承受的范圍，在該鹽度條件下，小黃魚通過自身的調(diào)節(jié)可以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。而在高鹽組中出現(xiàn)少量個體死亡，表明高鹽的脅迫已超出部分個體機體內(nèi)部調(diào)節(jié)的范圍，同時也表明小黃魚個體間對高鹽的適應具有較大的差異性，該現(xiàn)象對于通過選擇育種培育耐高鹽的優(yōu)良品種（系）具有重要意義。

4.2 鹽度脅迫對小黃魚肝臟抗氧化酶活力的影響

肝臟是魚類新陳代謝的主要器官，在機體抗氧化、糖原合成、分泌膽汁等生理過程中發(fā)揮著重要作用[25]。魚類在鹽度脅迫下，由于應激反應會產(chǎn)生過多的氧自由基，機體自身的自由基量和抗氧化能力的動態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生氧化脅迫[5]。為了抵御氧化脅迫，抗氧化防御系統(tǒng)得到了調(diào)用。其中，SOD 和CAT 是抗氧化系統(tǒng)重要的組成部分，SOD 能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受氧化損傷。清除過程中產(chǎn)生的H2O2能在CAT 的催化下生成H2O 和O2，二者協(xié)同作用，保護肝臟組織免受損傷[26]。已有研究表明，鹽度、水溫等環(huán)境條件的變化可引起魚體中抗氧化酶活力改變，如低鹽脅迫下，黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）肝臟SOD 活力變化顯著[23]，點籃子魚（Siganus guttatus）不同組織CAT 活力增強[27]；條石鯛（Oplegnathus fasciatus）幼魚肝臟中SOD 和CAT 活力隨著鹽度升高逐漸增強[28]。本研究中，鹽度脅迫導致小黃魚肝臟中SOD 和CAT 活力均呈現(xiàn)不同程度的上升。表明鹽度脅迫會造成機體中大量的自由基積累，而抗氧化酶活力的升高可以一定程度降低肝臟組織的損傷。

4.3 鹽度脅迫對小黃魚肝臟磷酸酶活力的影響

ACP 和AKP 主要在免疫反應中負責轉(zhuǎn)運與代謝磷酸基團，通過巨噬細胞溶酶體對細胞體起到重要的代謝調(diào)控作用，是免疫防御體系中重要的水解酶[29]。本次研究發(fā)現(xiàn)，小黃魚肝臟中的AKP 活力在低鹽下受到明顯抑制，但隨著鹽度升高不斷增強。在房子恒等[30]對半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，AKP 活力在鹽度為0～20 的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢。原因可能是海水中金屬離子含量的升高對AKP 活力具有顯著的促進作用[31]。據(jù)此推測，鹽離子濃度的增加對小黃魚肝臟組織的AKP 活力有一定的促進作用。白秀娟等[32]和李娜等[33]的研究均指出鹽離子濃度增加，ACP 活力受到抑制。本次研究發(fā)現(xiàn)，高鹽組ACP活力顯著低于對照組，受到明顯的抑制，研究結(jié)果與上述報道結(jié)果相一致，這可能是由水環(huán)境中的離子濃度變化抑制了ACP 的合成和分泌，導致其活力降低[33]。

4.4 鹽度脅迫對Na+K+-ATP 酶活力的影響

在水環(huán)境中，魚類主要依賴鰓絲中的泌氯細胞（MR 細胞）完成滲透壓調(diào)節(jié)中的離子排放，泌氯細胞表面蘊含著豐富的Na+/K+-ATP 酶[34]。Na+/K+-ATP 酶在生物體內(nèi)離子調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要作用，其功能是保持細胞內(nèi)高K+、細胞外高Na+的離子濃度梯度平衡[25]。鰓和腎臟是魚類滲透濃度調(diào)節(jié)和離子運輸?shù)闹饕鞴?，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和滲透平衡中發(fā)揮重要作用[4]。在鹽度脅迫條件下，Na+/K+-ATP 酶活力發(fā)生明顯變化。研究表明[7]，當鹽度降至15 時，克氏雙鋸魚鰓絲Na+/K+-ATP 酶活力在第96 h 穩(wěn)定后出現(xiàn)最小值，低于其他鹽度組。花鱸（Lateolabrax maculatus）在鹽度為10 的環(huán)境下，Na+/K+-ATP 酶活力最低[35]。本次研究中發(fā)現(xiàn)，低鹽組小黃魚鰓絲的Na+/K+-ATP 酶活力最低，顯著低于高鹽組，研究結(jié)果與上述報道相一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能是魚類通過降低鰓絲中Na+/K+-ATP 酶活力，減少細胞對Na+、Cl?離子的通透性，阻止了Na+、Cl?離子流動，以此適應生存環(huán)境的鹽度變化[34]。高鹽脅迫時，小黃魚腎臟中Na+/K+-ATP 酶活力顯著增強。據(jù)李學軍等[36]報道，羅非魚（Oreochromisspp）腎臟中Na+/K+-ATP 酶活力隨鹽度的升高而增強。在最高和最低鹽度條件下，條石鯛腎臟中Na+/K+-ATP 酶活力均顯著高于對照組[37]。卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）腎臟組織中的Na+/K+-ATP 酶活力在24 h 的高鹽脅迫下顯著性高于對照組[38]。腎臟組織中的Na+/K+-ATP 酶活力在24 h 的高鹽脅迫下顯著性高于對照組。這些均與本研究有相似之處，說明為了維持高滲環(huán)境下魚體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，腎臟中的Na+/K+-ATP 酶活力增強，使機體建立起新的滲透壓平衡。研究指出，在低鹽環(huán)境中，廣鹽性魚類由于滲透代謝水平較低，從而可以消耗更多能量去用于生長，生長水平相比海水環(huán)境可能更占據(jù)優(yōu)勢[35,39?40]。一定程度上表明，小黃魚在低鹽環(huán)境中所需滲透代謝耗能較少，從滲透代謝方面來講，相比較高鹽度海水更有利于小黃魚的生長，此結(jié)果對于進行小黃魚低鹽度或者淡化養(yǎng)殖均有較好的指導意義。

5 結(jié)論

綜上所述，小黃魚幼魚對鹽度有較強的調(diào)節(jié)能力。急性鹽度脅迫下，小黃魚幼魚能夠及時調(diào)動非特異性免疫酶、Na+K+-ATP 酶進行體內(nèi)生理調(diào)節(jié)，消除機體過多的自由基和維持內(nèi)外環(huán)境的滲透壓平衡。在低鹽條件下，小黃魚存活率較高且所需滲透代謝耗能較少，為今后小黃魚咸淡水養(yǎng)殖提供理論參考。但在高鹽下，魚體內(nèi)環(huán)境遭到破壞，自由基代謝紊亂，抗氧化防御機制受到影響，導致機體免疫能力降低，個體之間對高鹽耐受能力差異較大，為耐鹽品種選育奠定了基礎(chǔ)。