馮洲旭，張根生，孔令杰，喬江濤，肖興英，張紅城*

（1.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150010；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京100093）

蜂花粉是工蜂采集植物雄蕊花藥或植物小孢子囊內(nèi)的花粉，加上自己特殊的腺體分泌物、唾液和花蜜初步加工而成的花粉球，呈淡黃色或綠色，味微甜、微苦[1]。向日葵蜂花粉為菊科向日葵屬植物向日葵（Helianthus annuus L.）的蜂花粉粉末[2]，是我國蜂花粉大宗交易品之一[3]。向日葵蜂花粉具有提高免疫力、抗衰老及美容養(yǎng)顏等作用[4]，其中主要含有氨基酸、脂類、礦物質(zhì)、類胡蘿卜素[5]、植物甾醇[6]、類黃酮[7]、酚酸衍生物[8]及酚胺類化合物等。其中，酚胺類化合物是一類結構上由酚?；c多胺或脫胺芳香族氨基酸偶聯(lián)而成的植物次生代謝產(chǎn)物[9]。酚胺在植物中廣泛存在，是植物生殖器官和種子中的主要酚類成分，并作為代謝中間或終產(chǎn)物在植物生長發(fā)育和抵御環(huán)境傷害方面發(fā)揮著重要功能作用[10]。目前，對蜂花粉中酚胺類物質(zhì)開展的研究相對較少，對向日葵蜂花粉中酚胺類化合物成分解析尚未有文獻報道。本研究采用高效液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight-mass spectrometry，HPLC-Q/TOF-MS）法，對向日葵蜂花粉中的8 種酚胺類化合物進行結構鑒定并進行定量分析，同時比較不同產(chǎn)地向日葵蜂花粉中酚胺類化合物的含量差異，以期為酚胺類成分的生物學活性及藥理學作用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

向日葵（Helianthus annuus L.）蜂花粉：中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所提供，采集地分別為內(nèi)蒙古（5 個）、黑龍江（5 個）和寧夏（5 個）。蜂花粉樣品采集后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

無水乙醇（分析純）：北京北化精細化學品有限公司；甲醇（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸（質(zhì)譜純）：美國Fisher 公司；三-對-香豆酰亞精胺、四-對-香豆酰精胺：哈爾濱商業(yè)大學蜂產(chǎn)品加工與功能評價實驗室自制；所有試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

LC-6AD 型高效液相色譜儀：日本島津公司；6520型四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀：美國Agilent 公司；BSA124S-CW 型分析天平：德國Sartorrius 公司；Merk超純水系統(tǒng)、0.22 μm 微孔濾膜：美國Merk Millipore 公司；Finnpipette F1 單道移液器：美國Thermo Scientific公司；JECHERS 自動樣品制備系統(tǒng)：中國上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；Thermo Sorvall Biofuge Startos 型臺式離心機：美國Thermo Fisher 公司；2 mL 無菌注射器：中國江蘇正康醫(yī)療器械有限公司；JC-QXS-4.5L 型數(shù)控超聲波清洗器：中國昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜂花粉樣品前處理

準確稱取3g 向日葵蜂花粉置于樣品管中，用75%乙醇溶解并定容至30 mL。樣品管中加入轉子后放入自動樣品制備系統(tǒng)，于頻率60 Hz 條件下運行120 s。后取出轉子，蜂花粉懸濁液在5 000 r/min 條件下離心10 min，以除去蜂花粉懸濁液中的固體不溶物。將離心后的上清液倒入試管中，從試管中吸取2 mL 上清液，0.22 μm 微孔濾膜過濾后，用于HPLC 分析。

1.3.2 色譜/質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為水（含0.2%乙酸），流動相B 為甲醇（含0.2%乙酸）；梯度洗脫程序為0～10 min，5%～20%B；10 min～25 min，20%～24%B；25 min～45 min，24%～30%B；45 min～50 min，30%～38%B；50 min～60 min，38%～40%B；60 min～70 min，40%～42%B；70 min～80 min，42%～44%B；80 min～90 min，44%～46%B；90 min～100 min，46%～48%B；100 min～110 min，48%～50%B；110 min～120 min，50%～52%B；120 min ～130 min，52%～54% B；130 min ～140 min，54%～56%B；140 min～150 min，56%～58%B；總流速為0.7 mL/min；柱溫箱溫度為36 ℃；檢測波長為280 nm；進樣量為20 μL。

質(zhì)譜條件：電離源為電噴霧離子化（electron spray ionization，ESI）；檢測模式為正離子掃描；加熱溫度為350 ℃；離子源噴出電壓為4 kV；出口電壓為130 V；氮氣流速為11 L/min；碰撞氣體為氦氣。

1.3.3 標準品溶液制備

稱取一定質(zhì)量的反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺（液相法制備，純度≥95%）、反，反，反，反-四-對-香豆酰精胺（液相法制備，純度≥95%）于10 mL 容量瓶中，加入75%甲醇溶解配制成10 mL 標準品儲備液。

2 結果與分析

2.1 向日葵蜂花粉中酚胺類化合物的定性分析

向日葵蜂花粉的HPLC 圖如圖1 所示。

圖1 向日葵蜂花粉的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of sunflower bee pollen sample

分離并檢測出向日葵蜂花粉中所含有的8 種酚胺類化合物，這8 種化合物的名稱、相對保留時間、紫外光譜最大吸收波長（λmax）、分子量及質(zhì)譜有關信息詳見表1。

化合物1、2、3、5 相對分子質(zhì)量相同，均為583Da，4 個峰二級質(zhì)譜斷裂相同，見圖2。

準分子離子碎片峰584 m/z[M+H]+在斷裂1 個香豆酰碎片后，產(chǎn)生分子離子碎片峰438 m/z[M+H]+，而后繼續(xù)斷裂1 個香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰292 m/z[M+H]+，第3 次斷裂1 個香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰146 m/z[M+H]+，最終相對分子質(zhì)量145 Da即為亞精胺相對分子質(zhì)量。由于反式香豆酰屬于平面型結構，雙鍵與處于同一平面的苯環(huán)容易形成π-π 共軛。對于順式香豆酰，由于空間位阻，造成雙鍵與苯環(huán)處于非平面，不易發(fā)生共軛，故而順式與反式的紫外最大吸收波長略有不同[11]。所以與順式相比，反式的最大吸收波長位于長波端?；衔?、2、3、5 的最大吸收波長分別是270、280、290、298 nm，分別對應順，順，順-三-對-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對-香豆酰亞

精胺、反，順，反-三-對-香豆酰亞精胺和反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺。另外，順式異構體是兩個電負性相同的原子或原子團處在分子的同側，造成偶極矩的疊加，增加不對稱性，而不像反式那樣比較對稱地排列，因而順式分子的偶極距比反式大，為偶極分子，有較弱的極性。因此順式出峰時間早于反式，化合物1、2、3、5 分別對應順，順，順-三-對-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對-香豆酰亞精胺、反，順，反-三-對-香豆酰亞精胺和反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺。李石飛等[12-14]和LI W C 等[15]運用不同的檢測方法在紅花中鑒定出4 種亞精胺成分并進行了結構分析，經(jīng)過比對，向日葵蜂花粉中的4 種亞精胺成分與紅花中4 種亞精胺成分吻合。因此，將化合物1、2、3、5 分別鑒定為順，順，順-三-對-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對-香豆酰亞精胺、反，順，反-三-對-香豆酰亞精胺、反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺，其分子結構如圖3 所示?；衔?、6、7、8 相對分子質(zhì)量相同，均為786 Da，4 個峰二級質(zhì)譜斷裂相同，見圖4。

表1 向日葵蜂花粉酚胺類化合物HPLC-Q/TOF-MS 分析結果Table 1 Analysis results of phenolamides in sunflower bee pollen by HPLC-Q/TOF-MS

圖2 化合物1、2、3、5 的一級和二級質(zhì)譜圖Fig.2 Primary and secondary mass spectra of compounds 1，2，3 and 5

圖3 鑒定的三-對-香豆酰亞精胺化合物分子結構圖Fig.3 Molecular structures of tri-p-coumaroylspermidines identified

圖4 化合物4、6、7、8 的一級和二級質(zhì)譜圖Fig.4 Primary and secondary mass spectra of compounds 4，6，7 and 8

準分子離子碎片峰787 m/z[M+H]+在斷裂第1 個香豆酰碎片后產(chǎn)生分子離子碎片峰641 m/z[M+H]+，而后繼續(xù)斷裂第2 個香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰495 m/z[M+H]+，第3 次斷裂1個香豆酰碎片產(chǎn)生分子離子碎片峰349 m/z[M+H]+，第4個分子離子碎片204 m/z[M+H]+為1 個香豆酰與3 個烷基的組合斷裂。

圖5 鑒定的四-對-香豆酰精胺化合物分子結構圖Fig.5 Molecular structures of tetra-p-coumaroylspermines identified

鑒于目前尚未有關于四-對-香豆酰精胺的文獻報導，故而依據(jù)上述分子量為583 Da 的三-對-香豆酰亞精胺的結構推導過程，對分子量為786 Da 的四-對-香豆酰精胺進行合理推測，化合物4、6、7、8 分別為順，順，順，順-四-對-香豆酰精胺、反，順，順，反-四-對-香豆酰精胺、反，反，順，反-四-對-香豆酰精胺、反，反，反，反-四-對-香豆酰精胺，其分子結構如圖5所示。

2.2 向日葵蜂花粉中酚胺類化合物的定量分析

將反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺、反，反，反，反-四-對-香豆酰精胺標準品儲備液以5、10、15、20、25 μL 進樣量進行HPLC 色譜分析，以峰面積為縱坐標，上樣量（mg）為橫坐標建立標準品標準曲線，標準品的線性回歸方程和相關系數(shù)見表2。通過外標法測定不同產(chǎn)地向日葵蜂花粉中8 種酚胺類化合物的含量（詳見表3）。其中，順，順，順-三-對-香豆酰亞精胺、順，順，反-三-對-香豆酰亞精胺、反，順，反-三-對-香豆酰亞精胺含量以反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺計；順，順，順，順-四-對-香豆酰精胺、反，順，順，反-四-對-香豆酰精胺、反，反，順，反-四-對-香豆酰精胺含量以反，反，反，反-四-對-香豆酰精胺計。

由表3 可知，采收自3 個不同產(chǎn)地的向日葵蜂花粉中都含有上述8 種酚胺類成分，但其含量具有一定的差異性。4 種三-對-香豆酰亞精胺的總含量以黑龍江最高為21.88 mg/g，其次是內(nèi)蒙古為19.13 mg/g，寧夏最少為11.61 mg/g。在4 種三-對-香豆酰亞精胺中，以反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺的含量最高，其含量分別為內(nèi)蒙古8.37 mg/g、黑龍江9.16 mg/g、寧夏5.67 mg/g。4 種四-對-香豆酰精胺的總含量以內(nèi)蒙古最高為7.2 mg/g，其次是黑龍江為4.4 mg/g，寧夏最少為4.3 mg/g。在4 種四-對-香豆酰精胺中，以反，反，反，反-四-對-香豆酰精胺的含量最高，其含量分別為內(nèi)蒙古2.76 mg/g、黑龍江1.98 mg/g、寧夏1.95 mg/g。結果顯示，3 個產(chǎn)地的向日葵蜂花粉中反，反，反-三-對-香豆酰亞精胺和反，反，反，反-四-對-香豆酰精胺的含量均高于其另外3 種異構體形式化合物含量，這可能與其化學結構的穩(wěn)定性有關。

表2 標準品線性回歸方程和相關系數(shù)Table 2 The linear regression equations and correlation coefficient sof standard compounds

表3 不同產(chǎn)地向日葵蜂花粉中8 種酚胺類化合物含量Table 3 Contents of eight phenolamine compounds in sunflower bee pollens from different province

3 結論

本研究采用HPLC-QTOF-MS 法共鑒定出向日葵蜂花粉中存在的8 種酚胺類化合物，包括4 種三-對-香豆酰亞精胺和4 種四-對-香豆酰精胺。這是首次在向日葵蜂花粉中鑒定出這8 種酚胺類化合物。這些酚胺類化合物是一種帶正電荷的小分子[16]，不僅存在于蜂花粉中，在大米[17]和一些中藥材[18-20]中也有發(fā)現(xiàn)。酚胺類化合物有多種生物功能，例如在人體中，酚胺類化合物水平會隨著年齡的增長而下降，內(nèi)源性亞精胺濃度的降低和衰老之間可能存在聯(lián)系[21]。最近的流行病學數(shù)據(jù)顯示，增加多胺水平，包括提高膳食攝入量，通過誘導自噬機制延緩了衰老。酚胺類化合物，被看作“抗衰老維生素”[22]。此外，定量分析結果還為后期酚胺類成分的生物學活性及其藥理學作用的研究提供了基礎。