周美玲,于晉,屈直,王稚英

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,遼寧 錦州 121000)

烤瓷熔附金屬(porcelain fused to metals，PFM)全冠能完整恢復(fù)牙體的形態(tài)及功能，抗折力強，且顏色、外觀逼真，色澤穩(wěn)定，表面光滑，耐磨性和抗沖擊性強，是目前臨床上較為常用的固定修復(fù)方法。但牙科合金的金屬元素釋放是一個潛在影響牙科病人的健康問題[1]。眾所周知，金屬能引起皮膚的過敏或誘導(dǎo)炎癥發(fā)生反應(yīng)，而這些都是金屬元素被釋放的結(jié)果，其會造成相鄰組織的細胞生物毒性[2-3]。鑄造修復(fù)體被放置在與口腔組織密切接觸的各個不同部位可能會引起接觸部位或相鄰組織不良反應(yīng)如牙齦炎和牙周炎。鎳離子可以在人類口腔黏膜細胞和角質(zhì)形成細胞聚集，激活單核細胞和上皮細胞抑制或促進內(nèi)皮細胞的細胞間黏附分子1表達[4-5]。此外，鎳能夠誘導(dǎo)表面抗原的表達調(diào)控，而高濃度的LPS影響刺激巨噬細胞的基本功能[6-7]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)已被報道與許多骨吸收和炎癥相關(guān)，導(dǎo)致細胞增殖，細胞遷移，細胞凋亡和壞死。本研究主要研究兩種金屬全冠修復(fù)體對于犬牙齦組織中TNF-α和NF-κB的表達量，用于對臨床種植體上的金屬全冠的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

金剛砂車針(日本MANI)、硅橡膠印模材(瑞士康特coltene RAPID LINER)、美佳境A+種植體(臺灣美佳境)、3M ESPE水門汀粘結(jié)劑、環(huán)氧樹脂(美國3M ESPE公司)；鎳鉻合金(北京樂樂嘉齒科有限公司)；鈷鉻合金(鈷不少于25%，鉬不少于4%，鈷、鎳、鉻3種加起來不少于85%，北京樂樂嘉齒科有限公司)；LEICA EM UC6超薄切片機(德國 LEICA公司)；JEM-1200EX 型透射電子顯微鏡(日本電子公司)；ZEISS A1光學(xué)顯微鏡(ZEISS 公司)；CIAS-1000型細胞圖像分析儀(北京大恒圖像視覺有限公司)。

1.2 實驗動物選擇及分組

選擇清潔級、健康成年雄性雜種犬12只，年齡2歲，質(zhì)量15～18 kg。前期試驗中每只犬每側(cè)下頜均有2顆種植體；右側(cè)制作鎳鉻合金PFM冠，左側(cè)制作鈷鉻合金PFM冠，上頜同名牙位為正常對照組。實驗動物由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗于2017年9月至2018年2月在錦州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院口腔科學(xué)實驗中心完成。實驗動物犬生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2010-0002。

1.3 標(biāo)本獲取與處理

1.4 牙齦組織病理變化

切取每顆修復(fù)體對應(yīng)的犬牙齦及其上頜同名牙位健康犬牙齦一小塊，放入質(zhì)量濃度為4%多聚甲醛固定液中固定24 h。常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，制成5 μm厚切片，行HE染色。光鏡下牙齦組織病理變化。

1.5 Western Blot檢測NF-κB、TNF-α的表達

組織蛋白提取，配制SDS-PAGE凝膠進行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜浸泡于含5%的脫脂乳的PBS中，4 ℃封閉過夜。次日，棄掉封閉液，立即加入一抗(稀釋，稀釋液為5%的脫脂乳)與PVDF膜一同在37 ℃水平搖床中孵育1 h。棄掉稀釋的一抗溶液，PBST漂洗3次，每次5 min，以二抗(稀釋，稀釋液為5%的脫脂乳)孵育，室溫水平搖床中孵育1 h。棄掉二抗，PBST漂洗3次，每次5 min。孵育底物1 min。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，比較正常對照組與各處理組之間是否有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

術(shù)后各組犬均成活，精神狀態(tài)、飲食、活動正常，全冠無脫落進入結(jié)果分析。

2.1 術(shù)后牙齦組織形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后第3個月：光鏡下觀察到鎳鉻實驗組，鈷鉻實驗組牙齦組織形態(tài)均有充血，炎性細胞浸潤，細胞空泡，而正常對照組血管充血較輕，炎細胞浸潤不明顯，見圖1A、圖1B、圖1C。

術(shù)后第6個月：鎳鉻實驗組牙齦有充血，炎性細胞浸潤，空泡面積比鈷鉻合金組要多，并且棘層增生明顯，而正常對照組炎細胞浸潤不明顯，見圖2A、圖2B、圖2C。

術(shù)后第12個月：鎳鉻合金牙齦組織的炎癥細胞浸潤，棘層變化明顯，重度異常增生，并突破基底膜向結(jié)締組織侵潤生長，鈷鉻合金組牙齦組織無炎癥，無血管充血，正常對照組炎細胞浸潤不明顯，見圖3A、圖3B、圖3C。

2.2 Western blot檢測

2.2.1 NF-kB的表達情況

鎳鉻合金組在術(shù)后3個月有少量表達，與鈷鉻合金組相有明顯差異(P<0.05)，術(shù)后6個月、12個月與鈷鉻合金組相比顯著表達(P<0.01)，在12個月表達量最多，見表1、圖4。

A：正常對照組；B：鎳鉻合金修復(fù)體;C：鈷鉻合金修復(fù)體

A：正常對照組；B：鎳鉻合金修復(fù)體;C：鈷鉻合金修復(fù)體

A：正常對照組；B：鎳鉻合金修復(fù)體;C：鈷鉻合金修復(fù)體

表1 NF-kB在不同時期的表達量的灰度值比較

2.2.2 TNF-α的表達情況

鎳鉻合金組在術(shù)后3個月有少量表達，與鈷鉻合金組相有明顯差異(P<0.05)，術(shù)后6個月12個月與鈷鉻合金組相比顯著表達(P<0.01)，在12個月表達量最多，見表2、圖4。

表2 TNF-α在不同時期的表達量的灰度值比較

圖4 Western blot結(jié)果

3 討 論

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，口腔中的金屬材料在戴用一段時間后，在合金周圍的刮片及牙齦中均可發(fā)現(xiàn)析出的金屬離子，唾液中的離子濃度也會升高，產(chǎn)生不利的生物學(xué)效應(yīng)[8-10]，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在HE染色中，鎳鉻合金會造成牙齦組織形態(tài)學(xué)的改變，并且隨著時間的延長呈加重趨勢，說明這些釋放的金屬元素和其他的蛋白結(jié)合形成有害于局部或者全身的化合物，造成機體損害。有研究顯示長期接觸低濃度的Ni和Cr離子元素，可能導(dǎo)致在腎臟的積累[11]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金組會導(dǎo)致有牙齦炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生的主要因素常常是炎癥前遞質(zhì)的功能紊亂，因此評估合金的生物相容性可以考察其對炎癥前遞質(zhì)分泌和表達的影響，其中TNF-α無論對于一般的組織還是牙周組織都是重要的炎性遞質(zhì)。何慧明等[12]研究表明，用LPS刺激不同牙科金屬材料，TNF-α、白細胞介素1α等細胞因子會被單核細胞或巨噬細胞分泌。Horowitz等[13]人發(fā)現(xiàn)，把鈷鉻合金和巨噬細胞放到一起培養(yǎng)，可以導(dǎo)致TNF-α的產(chǎn)生，但不會造成明顯的TNF-α、IL-6的產(chǎn)生。

口腔上皮組織在炎癥和腫瘤的入侵和改造的情況下，病變的炎癥或腫瘤組織組織會造成TNF-α激活NF-κB，造成基質(zhì)TNF-α和NF-κB的過度表達，炎癥和腫瘤組織是它們之間鏈接的通道[14]。NF-κB促進白細胞介素2的轉(zhuǎn)錄和介入T細胞的活化及促炎性細胞因子的反應(yīng)，許多類型的細胞，如TNF、IL-1和細菌脂蛋白[15]。據(jù)Alifui-Segbaya等[16]的研究，在炎癥過程中激活NF-κB誘發(fā)病變的惡變，這種細胞因子參與T細胞的活化從而促進轉(zhuǎn)錄的IL-2和促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子的反應(yīng)；在炎性浸潤的條件下， NF-κB和TNF-α的過度表達呈正相關(guān)關(guān)系，本實驗研究證實了這一點。

實驗Western blot檢測表明鎳鉻合金引起NF-κB和TNF-α分泌的增加在第3個月和第6個月第12個月均有，鈷鉻合金在第3個月和第6個月均引起NF-κB和TNF-α的增加，但第12個月NF-κB和TNF-α減少，實驗結(jié)果表明，隨著時間的延長，各種金屬材料間的刺激性有差異，不同材料對于細胞因子的分泌影響是不同的，并且在相同條件下，NF-κB和TNF-α的表達呈正相關(guān)關(guān)系。

本實驗采用Western blot對鎳鉻合金和鈷鉻合金修復(fù)后局部牙齦組織的NF-κB及TNF-α的分析結(jié)果表明：種植戴用兩種修復(fù)體3個月后，局部牙齦組織中的NF-κB及TNF-α含量升高，說明戴用兩種修復(fù)體后，基底合金金屬離子會滲透到牙齦組織中，并且HE染色發(fā)現(xiàn)細胞核固縮，空泡性變，表明局部有炎癥的產(chǎn)生，并且黑白灰度值檢測中發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金和鎳鉻合金兩者之間有差異，說明兩種金屬間刺激性不同；戴用6個月后，鎳鉻合金周圍牙齦組織中的NF-κB及TNF-α表達含量持續(xù)增高，鈷鉻合金修復(fù)體周圍的NF-κB及TNF-α表達含量有所減少，灰度值的檢測發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金和鎳鉻合金有明顯差異，HE染色圖片發(fā)現(xiàn)鎳鉻合金中的上皮棘層組織增生要比鈷鉻合金明顯，說明鈷鉻合金的炎癥逐漸減輕，鎳鉻合金隨著時間的增加有加重趨勢；戴用兩種修復(fù)體12個月后，鎳鉻合金的NF-κB及TNF-α表達含量持續(xù)增多，鈷鉻合金的NF-κB及TNF-α表達含量持續(xù)降低，兩者之間的黑白灰度值檢測發(fā)現(xiàn)，鈷鉻合金與鎳鉻合金相對比有顯著差異，HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈷鉻合金組上皮組織恢復(fù)明顯，而鎳鉻合金組上皮重度異常增生，并突破基底膜向結(jié)締組織侵潤生長，說明隨著時間的延長，鎳鉻合金組的刺激明顯，炎癥因子的表達明顯，鈷鉻合金組隨著時間改變，癥狀逐漸減輕，表明兩者雖然刺激性不同，但是鈷鉻合金明顯優(yōu)于鎳鉻合金，鈷鉻合金組的NF-κB及TNF-α表達含量的減少的原因需要今后實驗的進一步的研究。