胡江鋒，張志剛，董劍輝，陳 瑞，黃文強

（1.楊凌綠方生物工程有限公司 712100；2.陜西省獸用生物制品工程技術研究中心 712100；3.陜西諾威利華生物科技有限公司 712100）

豬圓環(huán)病毒（PCV）病是由豬圓環(huán)病毒引起的豬的一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病[1]。 現(xiàn)已知PCV 有兩個血清型，其中PCV1 為非致病性病毒，不會對感染豬造成危害；PCV2 為致病性病毒，感染可引起豬斷奶后的多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、母豬繁殖障礙等多種相關疾病[2]。該病毒1974 年由德國學者Tischer 首先發(fā)現(xiàn)[3]，我國最早由朗洪武等于2001 年報道了PCV2 的存在[4]，目前，該病已普遍發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失[5]。 接種疫苗是預防該病的首要手段，而基因工程亞單位疫苗具有不會出現(xiàn)散毒、 同源重組以及發(fā)生變異的可能性等優(yōu)點[6]，受到市場的關注，但相比傳統(tǒng)的全病毒滅活苗或活疫苗， 由基因工程重組抗原組成的新型疫苗往往存在免疫原性弱等問題，需要免疫佐劑來增強其作用。 傳統(tǒng)獸用疫苗中常用的佐劑有鋁鹽佐劑和油佐劑， 鋁鹽佐劑在誘導T 細胞及Th1 型反應中作用有限， 在同高純度的小分子蛋白抗原共同使用時不能引起足夠的抗體應答；油佐劑皮下注射會引起炎癥、潰瘍和肉芽腫，且不易代謝，很難適應新型疫苗的發(fā)展[7]。因此，本試驗選用2種類型的新型佐劑制備豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗,并對其進行穩(wěn)定性、黏度、安全及效力的檢驗與綜合比較,以期為商品化豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗佐劑的選擇提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原 病毒含量測定合格，且滅活完全的豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗抗原液，蛋白含量為720μg/mL，蛋白純度為65%，由陜西諾威利華科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑 水包油佐劑Merckinade SDA25，購自賽德奧生物科技（北京）有限公司；雙向佐劑Montanide ISA 206，購自賽彼科（上海）特殊化學品有限公司； 豬圓環(huán)病毒2 型PCR 檢測試劑盒，購自青島立見診斷技術發(fā)展中心；豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA 抗體檢測試劑盒及豬繁殖與呼吸綜合征ELISA 抗體檢測試劑盒，購自武漢科前生物股份有限公司。

1.1.3 試驗動物 14～21 日齡的健康易感豬 （經豬圓環(huán)病毒2 型PCR 檢測試劑盒檢測PCV2 抗原為陰性、 豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA 抗體檢測試劑盒檢測PCV2 抗體為陰性、 豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA 抗體檢測試劑盒檢測抗體為陰性），購自陜西省興平市星光良種豬繁養(yǎng)殖有限公司。

1.2 方法

1.2.1 疫苗制備

1.2.1.1 Merckinade SDA25 佐劑疫苗：將滅活的抗原與Merckinade SDA25 佐劑按3∶1（質量比）準備，然后將滅活的抗原置于磁力攪拌器的燒杯中，開啟磁力攪拌器達300r/min，緩緩加入Merckinade SDA 25 佐劑，在15℃～25℃乳化10min。

1.2.1.2 Montanide ISA 206 佐劑疫苗： 將滅活的抗原與Montanide ISA206 佐劑按1∶1 （質量比） 準備， 然后分別加熱至30℃±2℃，將Montanide ISA206 佐劑倒入組織勻漿機中，以200r/min 攪拌，并將滅活抗原緩慢加入，待滅活的抗原加完后，提高攪拌速度至2000r/min，保持在30℃攪拌10min，接著一邊將苗液逐漸冷卻，一邊逐漸降低攪拌速度，至15℃時停機，在15℃以下靜置24h。

1.2.2 疫苗檢驗

1.2.2.1 穩(wěn)定性檢驗 取兩種疫苗各10mL 于離心管中，以3000r/min 離心15min。

1.2.2.2 黏度檢驗 兩種疫苗均按現(xiàn)行 《中華人民共和國獸藥典》方法[8]測定。

1.2.2.3 安全檢驗 將21 日齡PCV2 雙陰性（抗原、抗體）及豬繁殖與呼吸綜合征抗體為陰性的健康敏感豬15 頭隨機分為3組，每組5 頭。其中一組按2.0mL/頭于頸部肌肉注射Merckinade SDA25 佐劑疫苗；另一組按相同的方法、劑量注射Montanide ISA 206 佐劑疫苗；第三組以同樣的方法、劑量注射生理鹽水。 3 組豬分別隔離飼養(yǎng)，觀察14 日內的體溫及臨床癥狀，結合14 日剖檢的各臟器病理變化，判定疫苗安全性。

1.2.2.4 效力檢驗 將14 日齡PCV2 雙陰性（抗原、抗體）及豬繁殖與呼吸綜合征抗體為陰性的健康敏感豬15 頭隨機分為3組，每組5 頭。 每種疫苗頸部肌肉注射一組實驗豬，1.0mL/頭，首免后14 日，以相同方式及劑量進行加強免疫一次，剩余一組實驗豬不接種疫苗，作為對照。 3 組豬分別隔離飼養(yǎng)，加強免疫后21 日，15 頭豬分別采血分離血清， 從1∶50 開始進行2 倍遞增稀釋血清至1∶6400，然后按豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA 抗體檢測試劑盒使用說明，制板、用酶標儀630nm 波長測各孔OD 值、計算（S-N）/（P-N）值、判定陰陽性、再確定各組實驗豬PCV2 抗體效價。 需要注意，只有滿足陰性對照OD630nm 均值＜0.3、陽性對照OD630nm 均值≥0.8 條件， 實驗方為成立；S 為樣品OD630nm值，P 為陽性對照OD630nm 均值，N 為陰性對照OD630nm 均值；樣品結果判定: 樣品（S-N）/（P-N）值≥0.16 為陽性；樣品（S-N）/（P-N）值＜0.16 為陰性。

2 結果

2.1 穩(wěn)定性 兩種疫苗離心后均無水相析出

2.2 黏度

兩種疫苗黏度均符合國家標準[9]（小于200cP）， 結果見表1。

表1 兩種疫苗黏度檢驗結果

2.3 安全性

2.3.1 體溫 接種后14 日內，兩種疫苗安全檢驗豬及對照豬體溫均正常，結果見表2。

表2 安全性試驗接種試驗豬體溫測定結果（℃）

2.3.2 臨床觀察 接種后14 日內，兩種疫苗接種豬的采食、飲水、精神狀況均正常，均無不良臨床反應，且疫苗吸收良好，注射部位均無紅腫、硬塊等局部異常反應，與對照組無明顯差異。

2.3.3 剖檢 接種后的14 日，剖殺所有實驗豬，結果兩種疫苗接種豬及對照豬的心、肝、脾、肺、腎、及淋巴結均無病理變化。

2.4 抗體效價

加強免疫后21 日， 用豬圓環(huán)病毒2 型ELISA 抗體檢測試劑盒測定各組試驗豬PCV2 抗體效價。 結果表明，Montanide ISA 206 佐劑疫苗免疫豬抗體效價不低于1∶3200；Merckinade SDA 25 佐劑疫苗免疫豬抗體效價介于1∶800～1∶1600； 對照豬抗體效價不高于1∶50，結果見表3。

表3 實驗豬血清ELISA 抗體檢測結果

3 結論

隨著基因工程亞單位疫苗的深入研究， 其抗原不能誘導機體產生較強免疫應答的缺陷顯現(xiàn)出來， 彌補這一缺陷常用的方法是選用合適的佐劑來刺激機體，提高機體對抗原的免疫應答，增強免疫效果。 通過本實驗，筆者認為Montanide ISA 206 佐劑為豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗比較理想的佐劑， 它不但具有安全、無毒、粘度低、易吸收、無不良反應、增強免疫應答的特點，而且使用它，還可以節(jié)約抗原使用量，適合商品化、規(guī)?；a的要求。