李 曼，李宏娟，馬珊珊，楊趙偉

（秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心 066000）

阿維菌素類(lèi)藥物（Avermectins, AVMs）是由鏈霉菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素， 是目前獸醫(yī)臨床上用量最大的抗寄生蟲(chóng)藥，被廣泛應(yīng)用于牛、羊等動(dòng)物,在動(dòng)物體內(nèi)殘留時(shí)間長(zhǎng)[1-2]。 其作用機(jī)理是干擾害蟲(chóng)神經(jīng)生理活動(dòng)，致使害蟲(chóng)出現(xiàn)麻痹而中毒死亡[3]。 阿維菌素類(lèi)藥物對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性很低，但是長(zhǎng)期食用含有此類(lèi)藥物的奶產(chǎn)品會(huì)對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生潛在威脅,應(yīng)對(duì)奶產(chǎn)品中阿維菌素類(lèi)藥物含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)[4]。

GB/T 29696-2013 《牛奶中阿維菌素類(lèi)藥物多殘留的測(cè)定高效液相色譜法》 適用于牛奶中阿維菌素類(lèi)藥物殘留檢測(cè)的制樣和高效液相色譜測(cè)定方法， 該方法檢測(cè)靈敏度高且不需要昂貴的儀器，普及性強(qiáng)[5-6]。 本文通過(guò)對(duì)該方法中的前處理方法和儀器檢測(cè)條件進(jìn)行改進(jìn)， 使該方法適用于羊奶中阿維菌素類(lèi)藥物的檢測(cè)，對(duì)有效監(jiān)控該藥在羊的養(yǎng)殖中的應(yīng)用、評(píng)價(jià)羊奶食用的安全性具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 儀器

高效液相色譜儀（型號(hào)為U3000），購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；熒光檢測(cè)器（型號(hào)為FLD-3100），購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；漩渦振蕩器（型號(hào)為MS 3），購(gòu)自IKA 公司；智能高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)為3H20RI），購(gòu)自湖南赫西儀器裝備有限公司； 固相萃取濃縮裝置（型號(hào)為USE-24S），購(gòu)自北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；氮吹儀（型號(hào)為T(mén)TL-Ⅱ），購(gòu)自北京斯珀特科技有限公司； 電子天平（型號(hào)為XA205），購(gòu)自梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易 （上海） 有限公司； 電子天平 （型號(hào)為HZFA200），購(gòu)自福州華志科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑

阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥94%），購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司，?，斁貥?biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL）購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；甲醇（色譜純）購(gòu)自德國(guó)CNW 公司；乙腈（色譜純）購(gòu)自德國(guó)CNW 公司；冰乙酸（色譜純）購(gòu)自沈陽(yáng)市試劑五廠；三氟乙酸酐（化學(xué)純）購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司；三乙胺（分析純）購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；異辛烷（色譜純）購(gòu)自德國(guó)CNW 公司；N-甲基咪唑（色譜純）購(gòu)自西亞試劑；C18 固相萃取柱（500mg/6mL），購(gòu)自沃特世科技（上海）有限公司。

洗滌液：取乙腈30mL、去離子水70mL 和三乙胺20μL，混勻；

衍生化試劑A 液：取N-甲基咪唑1mL、乙腈1mL，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配；

衍生化試劑B 液：取三氟乙酸酐1mL、乙腈2mL，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

阿維菌素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液： 分別精密稱(chēng)取阿維菌素、 多拉菌素、伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品25mg, 用乙腈溶解并定容至25mL，配制成濃度為1mg/mL 的阿維菌素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于2℃～8℃保存。

?，斁貥?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取1mL ?，斁貥?biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋定容至10mL，配制成濃度為10μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于2℃～8℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別精密吸取阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100μL（儲(chǔ)備液由乙腈稀釋至濃度為100μg/mL),?，斁貥?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1mL，置于10mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素、埃瑪菌素濃度均為1μg/mL。

2.2 樣品的制備及處理

2.2.1 樣品的提取

稱(chēng)取羊奶試樣2.00g±0.05g（精確到0.01g）于50mL 具塞離心管中，加乙腈4mL，渦動(dòng)1min，5000r/min 離心10min，取上清液；殘?jiān)屑右译?mL，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，加去離子水10mL,、三乙胺25μL，混勻，備用。

2.2.2 樣品的凈化

C18 柱依次用乙腈5mL 和洗滌液5mL 活化， 取備用液過(guò)柱，自然流干，抽干5min，加異辛烷3mL 洗滌，抽干5min，乙腈5mL 洗脫，收集洗脫液于10mL 試管中，于55℃水浴吹干，備用。

2.2.3 樣品的衍生化

于備用試管中依次加入衍生化試劑A 液100μL、衍生化試劑B 液150μL，密閉，渦動(dòng)10s,依次加入冰乙酸50μL 和三乙胺50μL，渦動(dòng)10s,于室溫下密閉反應(yīng)30min,加甲醇650μL 混勻，過(guò)0.22μm 濾膜，供高效液相色譜法測(cè)定。

2.3 色譜條件確定

使 用 液 相 色 譜 柱 （型 號(hào) 為Accucore C18，150×4.6mm；2.6μm），進(jìn)樣量20μL，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)475nm，確定最佳的流動(dòng)相（甲醇和去離子水）組成，流速和柱溫。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取1μg/mL 阿維菌素類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量， 用乙腈稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?、10、20、50、100、200μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.0mL 于10mL 試管中，于55℃水浴吹干，依次加入衍生化試劑A 液100μL、衍生化試劑B 液150μL，密閉，渦動(dòng)10s,依次加入冰乙酸50μL 和三乙胺50μL，渦動(dòng)10s，于室溫下密閉反應(yīng)30min,加甲醇650μL 混勻，供高效液相色譜測(cè)定，以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 方法檢出限

按照上述2.2 方法進(jìn)行樣品處理， 根據(jù)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加回收率實(shí)驗(yàn)， 以3 倍信噪比可測(cè)得的最低質(zhì)量濃度確定方法的檢出限[7]。

2.6 準(zhǔn)確度和精確度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法， 在空白組織中添加3 個(gè)不同濃度（25μg/kg、50μg/kg 和100μg /kg）的阿維菌素類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率測(cè)定，每個(gè)濃度設(shè)定6 個(gè)平行樣品，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，重復(fù)3 次，計(jì)算該方法的準(zhǔn)確度和精確度。

3 結(jié)果與討論

3.1 確定色譜條件

在選定液相色譜和色譜柱的條件下，阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素、?，斁鼐玫胶芎玫姆蛛x，標(biāo)準(zhǔn)品依次在8.321min（阿維菌素）、11.113min （多拉菌素）、14.011min （伊維菌素）、16.164min（?，斁兀┏龇鍟r(shí)，此時(shí)流動(dòng)相組成為甲醇+去離子水=92+8，流速1.0mL/min，柱溫25℃。準(zhǔn)確吸取50μg/L 標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL， 重復(fù)進(jìn)樣10 次， 在相同色譜條件下對(duì)峰面積進(jìn)行分析，結(jié)果表明，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.33%，表明該色譜條件性能穩(wěn)定。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次從低濃度到高濃度進(jìn)行分析。按峰面積與對(duì)應(yīng)的對(duì)照溶液的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 其濃度在2～200μg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1，100μg /L 阿維菌素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

3.3 方法檢出限

羊奶空白樣品的色譜圖及羊奶空白樣品中添加50μg/kg阿維菌素類(lèi)藥物的色譜圖，見(jiàn)圖2～3，結(jié)果顯示空白試料對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾，各待測(cè)物的檢出限分別為阿維菌素1.2μg/kg、多拉菌素2.0μg/kg、伊維菌素2.3μg/kg、?，斁?.5μg/kg。

表1 阿維菌素類(lèi)藥物線性方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 阿維菌素類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（100μg /L）

圖2 羊奶空白樣品色譜圖

圖3 羊奶加標(biāo)樣品色譜圖（50μg /kg）

3.4 準(zhǔn)確度和精密度

羊奶中添加不同水平阿維菌素類(lèi)藥物回收率見(jiàn)表2。 如表所示，四種藥物回收率達(dá)到66.7%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.8%～5.4%。

表2 羊奶中阿維菌素類(lèi)藥物添加回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

羊奶中的阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素、?，斁氐人幬铮靡译婧腿ルx子水提取，C18 固相萃取小柱凈化，三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化，高效液相色譜-熒光法測(cè)定，回收率范圍為66.7%～104%， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～5.4%， 該方法的檢出限為1.2μg/kg～2.5μg/kg。 該方法穩(wěn)定性好，回收率高，檢測(cè)限低，具有良好的可操作性和重現(xiàn)性， 方法準(zhǔn)確度和精密度均能滿(mǎn)足獸藥殘留分析方面的要求，適用于羊奶中阿維菌素類(lèi)藥物殘留分析。