馬 倩，劉懿萱，開今言，郭 林，盧仁泉

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710000

卵巢癌是女性第5常見的癌癥［1］。在全球范圍內(nèi)，它是婦科腫瘤中死亡率排名第1的惡性腫瘤，每年約有239000例新診斷病例，每年有150000例死亡［2］。人類卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法包括手術(shù)與鉑類藥物（如卡鉑或順鉑）聯(lián)合化療。然而，盡管對(duì)鉑類藥物化療起始有效，多數(shù)晚期卵巢癌患者在單藥治療后仍會(huì)復(fù)發(fā)，并具有致命的后果［3］。對(duì)卵巢癌而言，疾病的分型至關(guān)重要［4-5］。卵巢癌有兩種主要的亞型，由組織來源決定，分為上皮性和非上皮性。上皮性卵巢癌是最常見的亞型，其特征是基因組不穩(wěn)定和對(duì)鉑類化學(xué)療法的敏感性［6］。

DNA修復(fù)的主要途徑有5種：錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）、堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）、核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）、同源重組（homologous recombination，HR）和非同源末端連接修復(fù)（non-homologous end joining，NHEJ）［7］。這些不同途徑之間的協(xié)同作用導(dǎo)致DNA修復(fù)和細(xì)胞存活。低水平的修復(fù)可能導(dǎo)致多種病理學(xué)變化，包括腫瘤的發(fā)生和對(duì)藥物耐藥性的產(chǎn)生［8-9］。Ku86，也稱為Ku80或X線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白5（X-ray repair cross complementing 5，XRCC5），與Ku70一起形成二聚體復(fù)合物，并通過非同源末端連接修復(fù)DNA雙鏈損傷（DNA double-strand break，DSB）［10］。Ku86參與人體的許多重要生理過程，目前對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞NHEJ的研究已應(yīng)用于腫瘤治療［10］。但是，關(guān)于Ku86在藥物敏感性方面的研究仍然很少。因此，本項(xiàng)目旨在研究Ku86在上皮性卵巢癌藥物敏感性中的作用，并探討Ku86與相關(guān)分子之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 組織樣本

卵巢癌組織和正常組織取自于2014—2016年在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科的原發(fā)性卵巢癌患者，患者通過病理學(xué)檢查確診。本研究得到復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（證書編號(hào)：050432-4-1212B），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

免疫組織化學(xué)分析使用抗Ku86 鼠抗體（sc-5280，美國Santa Cruz公司），并用PBS以1∶50稀釋。如前所述進(jìn)行免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）染色［11］。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)A2780和HO8910細(xì)胞系。將HEK-293T細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均在37 ℃培養(yǎng)箱中于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。上述試劑均購自美國Gibco公司。

1.4 順鉑處理細(xì)胞

將細(xì)胞以3×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中。將順鉑（2CL）添加到A2780和HO8910細(xì)胞培養(yǎng)液中，并以無順鉑的孔作為對(duì)照，將細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

1.5 建立Ku86或COP9信號(hào)復(fù)合體的第5種成分（the fifth component of the COP9 signalosome，COPS5）敲低的細(xì)胞模型

短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）是使用制造商的RNAi Designer程序設(shè)計(jì)的，其序列如表1所示。將shRNA克隆到pLKO.1-puro雙酶切質(zhì)粒（Age1和EcoR5）（美國Addgene公司）中，以產(chǎn)生重組質(zhì)粒。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）將重組質(zhì)粒，包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜載體pMD2.G（美國Addgene公司）轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中。48 h后，收集病毒上清液，并使用濃度為8 μg/mL的聚乙烯（美國Sigma-Aldrich公司）將其轉(zhuǎn)移至卵巢癌細(xì)胞系中24 h。使用2 mg/mL嘌呤霉素（美國Sigma-Aldrich公司）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞7 d。并通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)驗(yàn)證敲低效率。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

操作步驟和方法請(qǐng)參見參考文獻(xiàn)［11］。RTFQ-PCR中使用的特異性引物列于表2。

表1 用于轉(zhuǎn)染的shRNA序列Tab.1 Sequence of shRNA for transfection

表2 RTFQ-PCR的引物序列Tab.2 Primer sequences for RTFQ-PCR

1.7 Western blot檢測(cè)

Western blot的具體操作方法參見參考文獻(xiàn)［11］。用于檢測(cè)的抗體為：Ku 86（sc-5280，濃度1∶500，美國Santa Cruz公司），TOP1（ab121681，濃度1∶3000，美國Abcam公司），COPS5（濃度1∶1000，英國Bethyl公司），β-actin（60008-1-lg，濃度1∶3000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。蛋白質(zhì)條帶的密度通過Image J軟件（美國國立醫(yī)學(xué)圖書館）定量。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收獲細(xì)胞并重懸于0.5mL結(jié)合緩沖液中，然后與AnnexinV/PI 雙重染色劑（B D Biosciences）一起溫育15 min，最后通過流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.9 IC50檢測(cè)

將細(xì)胞接種到96孔板中，并用不同濃度的順鉑（0～64 μg/mL）處理48 h。之后向每個(gè)孔中加入CCK-8試劑（日本同仁化學(xué)研究所），并在37 ℃溫育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度（D）值。使用以下公式確定細(xì)胞存活率：（D實(shí)驗(yàn)-D背景）/（D未經(jīng)處理-D背景）/100%。使用非線性回歸計(jì)算與未處理的對(duì)照組相比存活的細(xì)胞降低了50%時(shí)順鉑的IC50值（GraphPad Prism v3.0）。

1.10 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

細(xì)胞在24孔板里的蓋玻片上生長，用預(yù)冷的PBS洗滌，在室溫下用4.0%多聚甲醛固定10 min，然后在0.5%Triton X-100上破膜15 min。用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉1 h后，將樣品與所需的第一抗體在4 ℃溫育過夜。洗滌后，將樣品與1∶5000稀釋的二抗（Alexa Fluor 488和594，美國Life Technologies公司）在室溫下于黑暗中溫育45 min。洗滌后，將樣品用含有DAPI（美國Invitrogen公司）的Prolong Gold防褪色試劑固定。使用多光子共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國LAS-AF-Lite公司）捕獲圖像。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過方差分析（ANOVA）和Studentt檢驗(yàn)來檢驗(yàn)組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ku86在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位及相關(guān)水平

首先在卵巢癌細(xì)胞中對(duì)Ku86進(jìn)行定位。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780中對(duì)Ku86進(jìn)行定位。用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行定位后發(fā)現(xiàn)，Ku86主要在細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞核膜上表達(dá)（圖1A）。使用IHC對(duì)來自于患者的癌和癌旁組織進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，Ku86在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)較多，并且與正常卵巢組織相比，Ku86在卵巢癌組織中的表達(dá)較高（圖1B）。以上結(jié)果說明Ku86在細(xì)胞內(nèi)存在于細(xì)胞核上，并且可能影響細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)。

圖1 Ku86在卵巢癌細(xì)胞內(nèi)主要定位于細(xì)胞核Fig.1 Ku86 was mainly localized in the nucleus in ovarian cancer cells

2.2 Ku86與TOP1在卵巢癌鉑類藥物敏感性中的關(guān)系

Ku 86 是DNA 依賴性蛋白激酶（DNAdependent protein kinase，DNA-PK）的調(diào)節(jié)亞基。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（topoisomerase Ⅰ，TOP1）也是一種細(xì)胞核酶，可在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中催化超螺旋DNA的松弛［12］。TOP1與藥物敏感性的研究成果已在臨床上應(yīng)用［13］。因此，接下來我們研究了Ku86與TOP1的關(guān)系，通過Oncomine（https://www.oncomine.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與對(duì)順鉑敏感的細(xì)胞相比，Ku86和TOP1的mRNA水平在對(duì)順鉑不敏感的細(xì)胞中都較低（圖2A）。為了探討Ku86和TOP1對(duì)于順鉑的敏感性，我們用不同濃度的順鉑處理A2780后，檢測(cè)了蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增高，TOP1的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而Ku86變化則不明顯（圖2B）。為了進(jìn)一步研究Ku86與TOP1在卵巢癌藥物敏感性中的關(guān)系，我們通過Gepia（gepia.cancer-pku.cn/）分析了Ku86和TOP1在卵巢癌中的表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果顯示，隨著Ku86 mRNA水平的上升，TOP1的mRNA水平也增高，呈現(xiàn)一種正相關(guān)的趨勢(shì)（圖2C）。接下來我們使用RANi技術(shù)在A2780細(xì)胞系將Ku86敲低。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，下調(diào)Ku86后TOP1表達(dá)明顯上調(diào)（圖2D）。Ku86與TOP1同為存在于細(xì)胞核上的兩種重要核酶，因此當(dāng)下調(diào)Ku86時(shí)，TOP1可能補(bǔ)償性升高。提示Ku86與TOP1存在明顯的相關(guān)性，推測(cè)Ku86與TOP1是一種競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系。

2.3 Ku86和COPS5在卵巢癌中的關(guān)系

COPS5通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)途徑在細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)中起重要作用。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，COPS5參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，近期也有文獻(xiàn)［14］表明，COPS5與卵巢癌的藥物敏感性有關(guān)。那么Ku86與COPS5的關(guān)系又如何呢？我們將Ku86敲低后檢測(cè)COPS5的變化，無論是在A2780還是HO8910細(xì)胞系中，與對(duì)照組相比，當(dāng)Ku86的mRNA水平下調(diào)時(shí)，COPS5的mRNA水平也明顯下調(diào)（圖3A～B）。在蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Ku86會(huì)導(dǎo)致COPS5的蛋白表達(dá)減少。而將COPS5敲低時(shí)，Ku86的蛋白表達(dá)水平不受影響（圖3C～D）。這些結(jié)果說明，Ku86會(huì)影響到COPS5，而COPS5不會(huì)影響到Ku86。進(jìn)一步查看Ku86和TOP1在卵巢癌中的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果顯示，當(dāng)Ku86表達(dá)較高時(shí)，COPS5的表達(dá)也較高（圖3E）。接下來我們通過Gepia探索了COPS5高表達(dá)和低表達(dá)時(shí)對(duì)卵巢癌患者生存情況的影響。結(jié)果顯示，在前60個(gè)月，COPS5的高表達(dá)與低表達(dá)對(duì)患者的生存狀態(tài)不產(chǎn)生明顯影響。但是60個(gè)月后，高表達(dá)COPS5的患者組與低表達(dá)COPS5的患者組相比表現(xiàn)出較好的生存情況（圖3F）。

2.4 順鉑處理后，下調(diào)Ku86使細(xì)胞凋亡減少

引發(fā)凋亡是鉑類藥物發(fā)揮抗癌作用的重要環(huán)節(jié)［14］。為了探究Ku86對(duì)順鉑藥物敏感性的影響，我們接下來檢測(cè)了在藥物作用下細(xì)胞的凋亡情況。加入2 μg/mL的順鉑處理細(xì)胞48 h后，使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在A2780和HO8910細(xì)胞系中，與對(duì)照組相比，下調(diào)了Ku86的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡程度較少（圖4A）。我們進(jìn)一步檢測(cè)了各組細(xì)胞的IC50，結(jié)果顯示Ku86下調(diào)組的細(xì)胞IC50值增加（圖4B），說明下調(diào)Ku86降低了卵巢癌細(xì)胞對(duì)于順鉑的敏感性。簡(jiǎn)而言之，下調(diào)Ku86會(huì)使TOP1表達(dá)升高，TOP1的高表達(dá)又會(huì)使細(xì)胞的凋亡程度減少。當(dāng)用順鉑處理卵巢癌細(xì)胞時(shí)，Ku86下調(diào)的細(xì)胞通過調(diào)控TOP1來使細(xì)胞的凋亡程度減少，使細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低。此外，下調(diào)Ku86也會(huì)使COPS5表達(dá)減少，但是如何通過調(diào)控COPS5來改變順鉑的敏感性仍有待研究（圖4C）。這些結(jié)果提示我們針對(duì)于Ku86的靶向治療可改變卵巢癌的順鉑敏感性。

圖2 Ku86與TOP1在卵巢癌鉑類藥物敏感性中的關(guān)系Fig.2 The relationship between Ku86 and TOP1 in cisplatin sensitivity of ovarian cancer

圖3 Ku86與COPS5在卵巢癌中的關(guān)系Fig.3 Relationship between Ku86 and COPS5 in ovarian cancer

3 討 論

Ku86通過參與NHEJ來修復(fù)DSB。異常的DNA損傷修復(fù)以及與之相關(guān)的細(xì)胞凋亡是鉑類藥物發(fā)揮作用的重要機(jī)制。但是，Ku86在鉑類藥物敏感性方面的作用與機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Ku86后由順鉑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞的IC50值增高，說明低水平的Ku86使細(xì)胞對(duì)順鉑的作用不敏感。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Ku86與TOP1和COPS5有顯著的相關(guān)性，Ku86可通過影響這兩個(gè)分子來調(diào)節(jié)藥物敏感性。

異常的DNA修復(fù)是導(dǎo)致鉑類藥物敏感性降低的重要機(jī)制。TOP1通過釋放轉(zhuǎn)錄或復(fù)制過程中產(chǎn)生的拓?fù)銬NA應(yīng)力在維持基因組完整性方面起著至關(guān)重要的作用［15］。喜樹堿（camptothecin，CPT）是一類重要的抗癌藥物，其發(fā)揮作用的機(jī)制主要是抑制TOP1［16］。已有研究報(bào)道，TOP1的抑制劑可以增加細(xì)胞凋亡率［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Ku86可導(dǎo)致TOP1表達(dá)明顯增高，并且在順鉑作用后，下調(diào)Ku86的細(xì)胞凋亡率較低，這種現(xiàn)象可能是Ku86通過調(diào)控TOP1來完成的。

圖4 Ku86的下調(diào)減少了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fig.4 Down-regulation of Ku86 reduces cisplatin-induced apoptosis

順鉑的化療抵抗一般是因?yàn)榧?xì)胞具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力。Ku86與TOP1同為參與DNA損傷修復(fù)的分子，它們的存在能夠有效修復(fù)受損斷裂的DNA，維持基因組穩(wěn)定性。加入順鉑處理會(huì)造成DNA雙鏈斷裂，Ku86能通過直接連接受損末端的方式進(jìn)行DNA修復(fù)，理論上下調(diào)Ku86的細(xì)胞會(huì)因?yàn)镈NA的損傷修復(fù)能力減弱而對(duì)順鉑更敏感。但實(shí)際上，由于下調(diào)Ku86會(huì)造成TOP1的補(bǔ)償性升高，有文獻(xiàn)［18-19］報(bào)道，TOP1可使DNA修復(fù)增加，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA的損傷產(chǎn)生抵抗，使基因組趨向穩(wěn)定，從而使細(xì)胞對(duì)順鉑不敏感。

COPS5最初被認(rèn)為是c-Jun輔助激活劑，也被稱為COP9信號(hào)復(fù)合體的第5種成分［20］。先前的研究表明，COPS5通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)途徑在細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)中起重要作用。最近，越來越多的證據(jù)［21-22］表明，COPS5在癌癥進(jìn)展中具有重要作用，包括DNA損傷反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Ku86可以導(dǎo)致COPS5的蛋白質(zhì)和mRNA水平下降。并且發(fā)現(xiàn)在卵巢癌疾病后期（60個(gè)月左右）COPS5的高表達(dá)對(duì)應(yīng)較好的生存率。敲低Ku86會(huì)使細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低，這是否與Ku86調(diào)控COPS5有關(guān)仍有待研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Ku86可以減少由順鉑引起的細(xì)胞凋亡，并且Ku86可以調(diào)控TOP1和COPS5，下調(diào)Ku86可使TOP1增多，使COPS5減少。Ku86、TOP1和COPS5都是參與DNA損傷修復(fù)的分子，而異常的DNA損傷修復(fù)是導(dǎo)致鉑類耐藥的重要機(jī)制。本文著重探討了卵巢癌中與鉑類藥物敏感性有關(guān)的生物標(biāo)志物之間的關(guān)系，提示針對(duì)Ku86的靶向治療可能是提高鉑類藥物化療敏感性的有效策略，未來有較好的應(yīng)用前景。