田 華，何小勇，王道猛，楊永國，梅 霞，錢 斌

1.揚州市江都人民醫(yī)院病理科，江蘇 揚州 225200；2.揚州市江都人民醫(yī)院胸外科，江蘇 揚州 225200

肺癌是世界范圍內(nèi)病死率第一位的惡性腫瘤，而腺癌是肺癌最常見的組織學(xué)類型，約占所有肺癌的50%［1］。目前研究［2］表明，大多數(shù)肺腺癌是通過肺泡上皮非典型腺瘤樣增生（atypital adenomatous hyperplasia，AAH）、原位腺癌（adenocarcinomain situ，AIS）、微浸潤性腺癌（microinvasive adenocarcinoma，MIA）到浸潤性腺癌（invasive adenocarcinoma，IA）這個癌變順序發(fā)展而來，但其具體機制尚不明確。腺苷酸激酶4（adenylate kinase 4，AK4）是一種調(diào)節(jié)腺嘌呤核苷酸代謝和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，研究發(fā)現(xiàn)AK4可促進肺癌細胞的轉(zhuǎn)移，且其表達與肺癌患者預(yù)后差密切相關(guān)。然而，AK4在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用還不十分清楚，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究AK4在肺腺癌發(fā)生過程中的不同階段的表達，同時分析其與IA臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，旨在探討AK4在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為肺腺癌的早期診斷提供一個生物標(biāo)志物，也為肺IA治療提供一個潛在的分子靶點。

1 資料和方法

1.1 病例資料

收集江蘇省揚州市江都人民醫(yī)院2017年1月—2019年12月胸外科手術(shù)切除的297例肺腺癌不同階段病變的標(biāo)本，所有病例均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，其中IA 152例，MIA 52例，AIS 60例和AAH 33例。同時選取因肺部非腫瘤性病變進行肺手術(shù)切除的肺組織30例作為正常對照。

1.2 免疫組織化學(xué)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)試劑

鼠抗人AK4單克隆抗體購自美國LifeSpan Biosciences 公司，工作濃度為1 ∶150；EnVision法免疫組織化學(xué)試劑盒、抗原修復(fù)液、DAB顯色試劑盒等購自美國Dako公司；H-E染色試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法

所有手術(shù)切除標(biāo)本均采用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋成蠟塊，然后使用切片機切片5 μm厚，分別進行H-E染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色采用EnVision法，主要步驟如下：切片先放置于67 ℃烤箱中烘片2 h，然后脫蠟至水后用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）沖洗3次，每次3 min；采用高壓鍋在高溫高壓下進行抗原修復(fù)，抗原修復(fù)液為枸櫞酸鈉緩沖液（pH為6.0），高壓鍋煮沸后繼續(xù)加熱2 min，然后自來水下自然冷卻，冷卻后取出玻片，先用蒸餾水沖洗2次，然后用PBS沖洗2次，每次3 min；切片滴加1滴3%H2O2，室溫下溫育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后PBS沖洗3次，每次3 min；切片上滴加一抗，放置濕盒中，4 ℃冰箱中溫育過夜；次日濕盒取出后置于室溫下30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加試劑A，室溫下溫育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加試劑B，室溫下溫育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加新鮮配制的DAB液，鏡下控制反應(yīng)時間，自來水終止染色；蘇木精復(fù)染，0.1% HCl分化，自來水沖洗，藍化，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判斷

所有免疫組織化學(xué)染色切片由病理科2名高年資主治醫(yī)師在雙盲條件下進行判讀，結(jié)果不一致者在多頭顯微鏡下共同閱片并達成一致。AK4陽性表達為顆粒狀胞質(zhì)陽性，結(jié)果判斷參照參考文獻［3］，先根據(jù)染色強度分為：無染色，0分；弱陽性，1+；中等陽性，2+；強陽性3+；然后根據(jù)陽性細胞百分比為25%進一步分為2組，AK4染色結(jié)果分為高表達和低表達，當(dāng)陽性細胞染色強度為2+或3+且陽性細胞比例＞25%為高表達，其余則為低表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。肺腺癌發(fā)生不同階段病變中AK4表達的差異采用χ2檢驗，IA中AK4表達與臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺IA臨床病理學(xué)特征

152例肺IA中，患者發(fā)病年齡52～73歲，平均62.6歲；男性90例，女性62例；腫瘤位于左肺66例，右肺86例；吸煙者55例，不吸煙者97例；腫瘤最大徑為1.1～5.3 cm，其中≤3 cm者102例，＞3 cm者50例；肺腺癌組織學(xué)類型以主要結(jié)構(gòu)作為該例主要組織學(xué)類型，腺泡型68例、貼壁型30例、微乳頭型22例、實體型16例、乳頭型16例；有淋巴血管侵犯者40例，無淋巴血管侵犯者112例；有胸膜侵犯者34例，無胸膜侵犯者118例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者53例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者99例；pTNM分期參照美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第8版進行分期，Ⅰ期92例，Ⅱ期60例。

2.2 AK4在肺腺癌不同階段病變中的表達

AK4陽性表達為細胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀陽性（圖1）。正常肺組織中，所有病例均無AK4表達。AK4在AAH、AIS、MIA和IA中的高表達率分別為63.6%、75.0%、71.1%和81.6%，均明顯高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。AK4在AIS與AAH、AIS與MIA、MIA與IA之間的高表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 AK4在肺腺癌發(fā)生不同階段病變中的表達Tab.1 Expression of AK4 in different lesions of lung adenocarcinoma

圖1 AK4在肺腺癌發(fā)生不同階段病變中的表達Fig.1 Expression of AK4 at different stages of carcinogenesis in lung adenocarcinoma

2.3 肺腺癌中AK4表達與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系

AK4高表達與肺腺癌患者的年齡、部位、吸煙狀態(tài)、腫瘤大小、脈管侵犯和胸膜侵犯無關(guān)（P＞0.05）。我們根據(jù)肺腺癌主要結(jié)構(gòu)作為該例最終的組織學(xué)類型，結(jié)果顯示，AK4在微乳頭型、實體型肺腺癌中高表達率雖然高于腺泡型、貼壁型和乳頭型腺癌，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。AK4在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌中高表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；pTNM分期中，Ⅱ期肺腺癌中AK4高表達率高于Ⅰ期肺腺癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 AK4高表達與肺IA臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系Tab.2 The correlation between high expression of AK4 and clinicopathological features in invasive adenocarcinoma of lung

3 討 論

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來盡管包括外科手術(shù)、放療、化療、靶向治療等多種治療方法取得了很大進展，但肺癌患者的總體預(yù)后仍然很差，所有分期的5年生存率僅為15%，而且僅有16%的肺癌患者可在早期得到診斷［4］。因此，尋找肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的基因改變對于評估患者預(yù)后、提供肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物，以及提供肺癌治療的靶點具有重要價值。

AK是多種生物活細胞中高能量磷酸化轉(zhuǎn)移反應(yīng)中的一類關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，在腺嘌呤核苷酸代謝和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［5］。目前在人體組織中發(fā)現(xiàn)了9種AK同工酶，它們共同調(diào)節(jié)不同細胞內(nèi)的腺嘌呤核苷酸組成，以維持細胞的能量動態(tài)平衡［6］。不同AK在細胞內(nèi)的定位不同，其中AK3和AK4表達于線粒體基質(zhì)中，AK4與AK3具有高度的序列同源。但與AK3不同，AK4已被報道在體外無酶活性，但仍保留其核苷酸結(jié)合能力，生理上與線粒體ADP/ATP轉(zhuǎn)運子相互作用，并作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白維持細胞存活［7］。

AK4在惡性腫瘤中的作用近年來已有相關(guān)報道。郭嘉寧等［8］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中AK4陽性表達高于癌旁組織，且AK4異常表達與前列腺癌復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移和生存時間短密切相關(guān)。龐亮等［9］對肌肉浸潤性膀胱癌AK4的研究發(fā)現(xiàn)，AK4在癌組織中高表達率顯著高于癌旁正常組織，AK4高表達率與遠處轉(zhuǎn)移和脈管內(nèi)瘤栓有關(guān)，生存分析顯示，AK4高表達患者生存時間短于低表達者。李辰運等［10］研究發(fā)現(xiàn)，AK4在胰腺癌組織中的表達高于癌旁組織，AK4的異常表達與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)受侵犯、脈管內(nèi)瘤栓相關(guān)，而且生存分析也提示AK4高表達患者生存時間短。Xin等［11］應(yīng)用免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，AK4高表達不僅與膀胱癌的腫瘤分期、遠處轉(zhuǎn)移和血管侵犯有關(guān)，還與膀胱癌患者不良預(yù)后相關(guān)，體外實驗研究顯示，AK4可促進膀胱癌細胞系的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhang等［12］研究發(fā)現(xiàn)，AK4可促進HER2陽性乳腺癌的進展。這些研究結(jié)果表明，AK4可以通過多種機制促進多種類型癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

AK4與肺癌的相關(guān)研究目前國外較少，而國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。Jan等［13］首先采用微陣列數(shù)據(jù)庫研究發(fā)現(xiàn)，AK4在肺腺癌中表達明顯高于正常肺組織，肺癌中AK4高表達與腫瘤分期晚、疾病復(fù)發(fā)及預(yù)后差有關(guān)，進一步分析顯示，AK4是通過下調(diào)ATF3從而促進肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。由于AK4的基因位于線粒體基質(zhì)中，可能涉及到代謝相關(guān)的基因，Jan等［3］進行的另一項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α活性在具有AK4代謝基因特征的肺癌中被顯著激活，AK4過度表達使代謝向有氧糖酵解方向轉(zhuǎn)變，增加細胞內(nèi)活性氧水平，從而穩(wěn)定HIF-1α蛋白水平，并以HIF-1α依賴性方式促進肺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。他們通過分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中肺腺癌RNA序列數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，相比于其他AK的基因，AK4和AK1的基因高表達者肺腺癌患者的預(yù)后更差，采用shRNA降低AK4的表達可降低表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的基因突變細胞中EGFR的蛋白表達［14］。這些研究中雖然發(fā)現(xiàn)AK4在肺腺癌中高表達，但在肺腺癌發(fā)生過程中是早期還是晚期事件尚不清楚。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分析了肺腺癌發(fā)生不同階段病變中AK4表達的變化，結(jié)果顯示從AAH到IA中，AK4表達均明顯高于正常肺組織，進一步分析顯示，隨著病變從AAH到腺癌進展，AK4表達率趨于增高，但它們之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究結(jié)果提示AK4可能參與了早期肺腺癌的發(fā)生，提示AK4檢測可以作為肺腺癌診斷的一個早期生物標(biāo)志物。

本研究對AK4高表達與肺腺癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系進行了分析，結(jié)果顯示，AK4高表達與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期密切相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性及高pTNM分期者的肺腺癌中AK4表達率明顯增高，本研究也進一步證實了AK4表達可以促進肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。AK4高表達與患者年齡、性別、吸煙狀態(tài)、腫瘤部位和脈管侵犯無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤最大徑＞3 cm和有胸膜侵犯者中AK4表達率高于腫瘤最大徑≤3 cm和無胸膜侵犯者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與本組資料中＞3 cm和有胸膜侵犯的肺癌病例數(shù)少有關(guān)，尚有待于后期進一步積累病例研究。肺腺癌具有高度的異質(zhì)性，同一肺腺癌可含有多種形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，我們以肺腺癌主要結(jié)構(gòu)進行AK4表達分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AK4表達率在實體型和微乳頭型腺癌中高于其他類型的腺癌，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，需要進一步擴大樣本量明確其意義。然而實體型和微乳頭型已被明確為具有侵襲性的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，因此，AK4表達肺腺癌在臨床生物學(xué)行為上可能具有高度侵襲能力，需要給予積極處理。

目前研究已經(jīng)證實肺腺癌可存在多個驅(qū)動基因改變，AK4與這些驅(qū)動基因改變是否存在相關(guān)性還不清楚。由于本組病例中僅有少數(shù)病例進行了肺癌驅(qū)動基因的檢測，我們未能進行這方面的相關(guān)分析，待以后肺癌驅(qū)動基因檢測的病例數(shù)足夠再進行深入的研究。

總之，AK4高表達在肺腺癌早期病變AAH中已經(jīng)開始出現(xiàn)，提示AK4可能在肺腺癌的早期發(fā)生階段發(fā)揮作用，AK4檢測可以作為早期肺腺癌診斷的一種生物標(biāo)志物。AK4高表達與肺腺癌的脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期密切相關(guān)，通過肺腺癌AK4的檢測可以更好地評估肺腺癌的惡性程度及預(yù)后。