王殿夫，齊 欣，李長(zhǎng)征，劉洪偉，麻麗丹*，楊希國(guó)

(1.遼東學(xué)院，遼寧 丹東118000；2.大連海關(guān)技術(shù)中心，遼寧 大連 116000；3.大東港海關(guān)，遼寧 東港 118300；4.丹東海關(guān)，遼寧 丹東 118000；5.遼寧通正檢測(cè)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110026)

0 引言

犀牛曾遍布地球，但由于偷獵及棲息地被破壞的原因，從70年代至今世界上的犀牛種群至少下降了85%[1].目前世界上僅存的犀牛共包含5個(gè)物種，即蘇門達(dá)臘犀(Dicerorhinussumatrensis)，非洲的白犀(Ceratotheriumsimum)和黑犀(Dicerosbicornis)，以及亞洲的印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rhinocerossondaicus)[2].犀牛角早在《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》和《藥性本草》等藥典中有過(guò)明確的記載，作為一種珍貴稀有的藥材，具有瀉火解毒、涼血止血、清心安神及治療癌癥的功效[3-7].而造成物種極度瀕危狀態(tài)的根源是犀牛角的珍貴[8].1977年起《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)將所有現(xiàn)存犀牛物種列入其附錄Ⅰ的監(jiān)管范圍[9-10].1993年5月，我國(guó)國(guó)務(wù)院發(fā)布的《關(guān)于禁止犀牛角和虎骨貿(mào)易的通知》(國(guó)發(fā)[1993]39號(hào))中嚴(yán)令禁止犀牛角的進(jìn)出口及用其制藥[11].近年來(lái)，由于犀牛角的稀少和珍貴使其價(jià)格飆升，犀牛的盜獵、非法貿(mào)易和走私等現(xiàn)象仍然有發(fā)生，更有一些不法分子為了牟取巨額利潤(rùn)用家畜角制品來(lái)仿制加工，以冒充真正的犀牛角[12].現(xiàn)市場(chǎng)上涉及的角骨類入藥藥材，由于其難以提取，造成了其鑒定工作的困難，無(wú)法配合質(zhì)檢、海關(guān)及公安部門的仲裁工作.因此，急需建立犀牛角制品準(zhǔn)確、快速的鑒定方法，為各執(zhí)法部門提供技術(shù)支持[13].隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA條形編碼(DNA Bar-coding)技術(shù)已成為一種新興的生物分類學(xué)方法，具有廣泛的應(yīng)用前景，不僅不受樣本形狀、形態(tài)等條件限制，也逐漸被應(yīng)用于珍貴藥材成分的鑒定中，以建立高效的物種鑒別技術(shù)方法[14-19].同時(shí)動(dòng)物角骨類藥材的條形碼多來(lái)自線粒體基因DNA和核基因.線粒體DNA不僅結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快，還嚴(yán)格按照母系遺傳，其控制區(qū)具有種群和個(gè)體的特異性，現(xiàn)已被國(guó)際上廣泛地應(yīng)用于物種鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域，也是藥物分子鑒定中DNA條形碼的重要來(lái)源[20].其中線粒體基因組中的12S rRNA基因，就被主要應(yīng)用在物種鑒定中[21].目前尚未見(jiàn)采用12S rRNA基因鑒定角類藥材的相關(guān)報(bào)道.

朝鮮牛黃安宮丸是安宮牛黃丸的成品制劑.本研究以涉案的朝鮮牛黃安宮丸為材料，對(duì)其消化處理后提取DNA，采用12S rRNA作為DNA條形碼基因片段，通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)分析，用于安宮牛黃丸中犀牛角成分的真?zhèn)舞b別方法，確定了安宮牛黃丸制品準(zhǔn)確及便捷的核酸提取和物種鑒別方法，為規(guī)范國(guó)內(nèi)和口岸安宮牛黃丸制品市場(chǎng)的監(jiān)管，打擊非法貿(mào)易提供有效的技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

本研究材料來(lái)自于涉案的朝鮮牛黃安宮丸，產(chǎn)品共計(jì)13份.同時(shí)采用犀牛角和山羊角分別作為試驗(yàn)陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本.

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

考慮角制品結(jié)構(gòu)堅(jiān)硬造成細(xì)胞膜不容易破碎，同時(shí)朝鮮牛黃安宮丸屬于深加工藥材，由于經(jīng)過(guò)加工處理造成DNA降解和提取工作的困難，綜合以上原因需對(duì)材料進(jìn)行前期消化處理.處理方法為：取檢材500 mg于50 mL離心管中，加入5 mL細(xì)胞裂解液(2%CTAB、100 mmoL Tris、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA、pH8.0)搖勻，充分混勻后55 ℃水浴中溫和震蕩消化過(guò)夜，置于65 ℃恒溫箱中溫育2 h.然后采用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒提取動(dòng)物組織基因組DNA.

1.2.2 PCR引物

采用合成12S rRNA 基因序列的通用引物對(duì)L1091/ H1478[22]對(duì)各檢材進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通用引物序列如表1所示.

表1 PCR反應(yīng)引物序列

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件

每50μL PCR反應(yīng)體系：5 μL 10×Ex Taq buffer(Mg2+plus)，4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)，0.25 μLTaKaRa Ex Taq(5 U/μL)，1 μL L1091(10 mol/L)，1 μL H1478(10 mol/L)，2 μL模板DNA，加ddH2O至50 μL.

PCR反應(yīng)參數(shù)：98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.

1.2.4 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將各PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，以DL2000 maker作為參照在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳情況.

1.2.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序

使用ABI 3500基因分析儀進(jìn)行測(cè)序分析.每份檢材的PCR產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測(cè)序，以保證所測(cè)序列的準(zhǔn)確性.

1.2.6 序列分析

檢材經(jīng)測(cè)序后獲得正反兩條序列，采用DNA Star 軟件(DNA Star，Inc)中的Seq Man 程序?qū)﹄p向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接處理[23].序列使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)[24]中的Blast程序進(jìn)行相似性分析比對(duì)，分別確定檢材的基因序列號(hào)后以鑒別其物種種類.

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

采用12S rRNA 基因序列合成的通用引物對(duì)犀牛角、山羊角和朝鮮牛黃安宮丸擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳后，擴(kuò)增片段如圖1至圖3所示.從圖1-3可知，犀牛角、山羊角及朝鮮牛黃安宮丸擴(kuò)增產(chǎn)物分別得到約500 bp、450 bp和500 bp條帶清晰的擴(kuò)增片段.由于朝鮮牛黃安宮丸本身制品為深加工產(chǎn)品，再加上其成分的復(fù)雜，13份涉案的朝鮮牛黃安宮丸中只有5份檢材(C-3～C-7)得到了目的性擴(kuò)增片段.該通用引物L(fēng)1091/ H1478對(duì)角制品類可以得到穩(wěn)定、亮度高的目的片段，能滿足DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定檢測(cè)上的基本試驗(yàn)要求.

圖1 犀牛角PCR擴(kuò)增電泳圖圖2 山羊角PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3 朝鮮牛黃安宮丸PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 測(cè)序結(jié)果及分析

將各檢材的目的片段測(cè)序后，使用NCBI 的Blast 程序分別對(duì)其進(jìn)行相似性的檢索及比對(duì)，只選取了各檢材相似序列的5個(gè)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行了列舉，結(jié)果見(jiàn)表2.其中犀牛角檢材(A1～A8)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與白犀(Ceratotheriumsimum)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可高達(dá)100.00%，同時(shí)在比對(duì)結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)犀牛角檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與黑犀(Dicerosbicornis)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性達(dá)96.25%，因此，自NCBI下載白犀和黑犀物種線粒體12S rRNA全序列同犀牛角檢材擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖可以看出犀牛角檢材擴(kuò)增產(chǎn)物序列和白犀(基因序列號(hào)：Y07726.1)12S rRNA基因部分序列比對(duì)結(jié)果完全一致，而和黑犀(基因序列號(hào)：FJ608807.1)12S rRNA基因部分序列比對(duì)結(jié)果存在16個(gè)堿基的差異，說(shuō)明在犀牛物種中白犀和黑犀親緣關(guān)系很近，兩者特征序列相差不大，才造成犀牛角檢材擴(kuò)增產(chǎn)物序列和黑犀12S rRNA基因序列的部分片段一致性達(dá)96.25%，犀牛角檢材應(yīng)為犀牛物種中的白犀；山羊角檢材(B-1、B-2)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與山羊(Caprahircus)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可高達(dá)99.51%；朝鮮牛黃安宮丸(C-3～C-7)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與非洲水牛(Synceruscaffer)線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段的一致性可達(dá)98.84%.使用相似性檢索及比對(duì)后，結(jié)果顯示本研究收集的對(duì)照樣本犀牛角和山羊角均具有較好的序列匹配度，采用12s rRNA 基因所鑒定的物種與實(shí)際收集檢材一致，從而驗(yàn)證角制品采用12S rRNA作為DNA條形碼基因片段進(jìn)行物種鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠.在對(duì)照樣本正常的情況下，5份涉案的朝鮮牛黃安宮丸與非洲水牛線粒體DNA的12S rRNA基因序列部分片段一致性大于98%可信度的一般要求，因此物種鑒定的結(jié)果為含有的是非洲水牛成分.

表2 檢材中12S rRNA基因的序列相似性比對(duì)

圖4 犀牛角檢材與白犀、黑犀的線粒體基因組中12S rRNA基因部分序列比對(duì)圖

3 結(jié)論

由于犀牛角珍貴稀有、神奇的藥效和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使犀牛物種瀕臨滅絕.在全球范圍內(nèi)珍稀瀕危物種非法貿(mào)易被公認(rèn)為是謀取超高額利潤(rùn)的違法活動(dòng)之一[25].中國(guó)始終支持禁止任何犀牛制品交易的禁令.因此，采用分子生物學(xué)方法精準(zhǔn)鑒定藥材中是否含有犀牛角成分，在打擊非法貿(mào)易和確定物種來(lái)源的案件中具有及其重要的意義.

由于角制品本身高度角質(zhì)化的特點(diǎn)就會(huì)增加試驗(yàn)提取的難度，再將其加工后微量入藥，與其他中藥基原成分進(jìn)行混合則更會(huì)造成基因組DNA含量的減少.本研究針對(duì)上述原因?qū)z材進(jìn)行有針對(duì)性的消化處理后，采用試劑盒提取基因組DNA，已從13份涉案的朝鮮牛黃安宮丸中鑒定出5份檢材是否含有犀牛角成分.說(shuō)明通過(guò)對(duì)檢材進(jìn)行前期的消化處理過(guò)程可得到較好質(zhì)量的DNA模板，提高針對(duì)角類藥材物種鑒別方法的靈敏度，而針對(duì)沒(méi)有得到目的擴(kuò)增片段的涉案檢材，如何從其復(fù)雜繁多的成分中更有效地提取DNA將作為下一步研究工作的重點(diǎn).通過(guò)測(cè)序、相似性檢索比對(duì)，表明采用位于線粒體上的12S rRNA基因序列的通用引物對(duì)L1091/ H1478可以準(zhǔn)確地辨別出犀牛角制品的真?zhèn)?本研究中涉案的朝鮮牛黃安宮丸經(jīng)DNA條形碼技術(shù)鑒定結(jié)果為非洲水牛(Synceruscaffer)，并非使用我國(guó)限制入藥的犀牛角.有研究表明水牛角和犀牛角均含有較多的Zn元素，為其可替代犀牛角提供了一定依據(jù)[26].針對(duì)角類制品及其藥材制品的物種鑒別，該方法的建立可以為各執(zhí)法部門相關(guān)案件的物種鑒定和量刑提供準(zhǔn)確可靠的依據(jù)，為珍稀瀕危物種的監(jiān)管和打擊非法貿(mào)易提供技術(shù)支持，從而更好地保護(hù)珍稀瀕危動(dòng)物犀牛，規(guī)范國(guó)內(nèi)和口岸犀牛角制品及其藥材制品的市場(chǎng).