王欣波，趙宇，袁星星

安神定志方對阿爾茨海默病大鼠海馬組織miR-103a-3p及其介導(dǎo)的Tau蛋白磷酸化的影響

王欣波1，趙宇1，袁星星2

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150006

觀察安神定志方對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠海馬組織miR-103a-3p及其介導(dǎo)的Tau蛋白磷酸化的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選AD海馬組織差異表達(dá)miRNA。50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、miR-103a-3p mimic組、安神定志方組和miR-103a-3p mimic＋安神定志方組，每組10只，采用Aβ1-42側(cè)腦室注射制備AD大鼠模型。造模后各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)4周。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，HE染色觀察海馬組織形態(tài)，RT-PCR檢測海馬組織miR-103a-3p基因的表達(dá)，Western blot和免疫組化檢測海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及Tau蛋白的表達(dá)。通過GEO數(shù)據(jù)庫共篩選出34個(gè)差異miRNA，其中17個(gè)上調(diào)、17個(gè)下調(diào)。與模型組比較，安神定志方顯著增加AD大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)和有效停留時(shí)間，減少逃避潛伏期，改善海馬CA1區(qū)組織形態(tài)，上調(diào)BDNF的表達(dá)，抑制miR-103a-3p、p-TauSer396和p-TauThr231的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。安神定志方可能通過抑制海馬組織miR-103a-3p的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BDNF的表達(dá)，調(diào)控Tau蛋白的磷酸化水平，從而促進(jìn)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

安神定志方；阿爾茨海默??；GEO數(shù)據(jù)庫；miR-103a-3p；Tau蛋白磷酸化；大鼠

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是臨床常見的神經(jīng)退行性疾病，約占所有癡呆類型的60%～80%。AD以細(xì)胞外β淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積形成的老年斑及細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)元纖維纏結(jié)為主要病理特征。迄今為止，AD發(fā)病確切機(jī)制尚未被完全詮釋，導(dǎo)致治療存在諸多不足，臨床多以對癥治療為主。AD屬中醫(yī)學(xué)“健忘”“癡呆”范疇。安神定志方出自《醫(yī)學(xué)心悟》，具有安神定志、化痰鎮(zhèn)驚功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，安神定志方活性成分對AD均有一定的治療作用[1-3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，安神定志方可通過激活BDNF/TrkB信號(hào)通路進(jìn)而抑制Tau蛋白的磷酸化水平，從而改善AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的能力[4]。本研究通過檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）上游miR-103a-3p的表達(dá)水平，為進(jìn)一步明確安神定志方的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究所用芯片數(shù)據(jù)下載于GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。獲得GSE129053數(shù)據(jù)集[5]，采用GPL18058平臺(tái)（Exiqon miRCURY LNA microRNA array，7th generation）。數(shù)據(jù)集以Aβ1-42誘導(dǎo)的AD模型和假手術(shù)大鼠海馬組織為研究樣本，每組3只，共6只。

1.2 數(shù)據(jù)處理

采用Bioconductor軟件的“l(fā)imma”包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行缺失補(bǔ)全、校正和歸一化處理。使用R軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行貝葉斯檢驗(yàn)，以adj＜0.05和|LogFC|≤2為條件對差異miRNA進(jìn)行篩選。

1.3 動(dòng)物及分組

50只雄性SD大鼠，體質(zhì)量（214±9）g，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（黑）2015003。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室，溫度21～24 ℃，相對濕度45%～55%，自由攝食飲水，每日光照時(shí)間12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、模型組、miR-103a-3p mimic組、安神定志方組和miR-103a-3p mimic＋安神定志方組，每組10只。

1.4 藥物及制備

安神定志方（黨參15 g，茯苓15 g，茯神15 g，龍齒25 g，遠(yuǎn)志5 g，石菖蒲5 g），飲片購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，加水浸泡，煎煮2次，合并藥液，過濾，濃縮至含原藥材40 mg /mL。

1.5 主要試劑與儀器

miR-103a-3p mimic，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成（A0018084），使用前將1 nmol/L的miR-103a-3p mimic溶液置于100 μL PBS，再將70 μL PBS與30 μL Lipofectamine 2000混合液（11668-026）與之混勻；Aβ1-42，美國Sigma公司，批號(hào)M2168；HE染色試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20190617；mirVana miRNA試劑盒，美國賽默飛世爾科技公司，貨號(hào)AM1556；BDNF、Tau、p-TauSer396、p-TauThr231和β-actin一抗兔多克隆抗體，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為P0015A、P0022A、P0023A、P0013、P0025；辣根過氧化物酶（HRP），沈陽萬類生物科技有限公司，貨號(hào)wl0715。腦立體定位儀（KW-DWY-S，南京卡爾文生物科技有限公司），微量注射儀（北京品超思瑞科技有限公司），Morris水迷宮（上海軟隆科技發(fā)展有限公司），CX23光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社），164-5052蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜儀（美國伯樂公司），ABI7500熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.6 模型建立及藥物干預(yù)

采用Aβ1-42側(cè)腦室注射建立AD大鼠模型[6]。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，將其固定于腦立體定位儀，側(cè)腦室定位參照《大鼠腦立體定位圖譜》[7]。采用微量注射儀向大鼠側(cè)腦室內(nèi)緩慢勻速注射濃度為1 g/L Aβ1-42溶液3 μL，空白組注射等體積生理鹽水，留針3 min，以1 mm/min速度緩慢退針，牙托粉封孔。術(shù)后第3日起大鼠給予相應(yīng)藥物干預(yù)，miR-103a-3p mimic組尾靜脈注射miR-103a-3p mimic 200 μL，安神定志方組給予安神定志方濃縮液（0.2 g/kg）1 mL灌胃，miR-103a-3p mimic＋安神定志方組給予miR-103a-3p mimic 200 μL尾靜脈注射聯(lián)合安神定志方濃縮液（0.2 g/kg）1 mL灌胃，空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

第21日采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，包括適應(yīng)性訓(xùn)練、定位巡航和空間探索3個(gè)部分，記錄大鼠逃避潛伏期、跨越平臺(tái)次數(shù)和有效停留時(shí)間，連續(xù)7 d。

1.7.2 HE染色

第29日大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取腦，分離海馬CA1區(qū)，4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察組織形態(tài)。

1.7.3 RT-PCR檢測

取部分海馬組織，根據(jù)試劑盒說明書使用mirVana miRNA試劑盒提取總miRNA，并用非編碼miRNA第一鏈互補(bǔ)DNA合成試劑盒對miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄至cDNA。引物miR-103a-3p：F 5’-ATCCAG TGCGTGTCGTG-3’，R 5’-TGCTAGCAGCATTGTAC AGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度92 bp；U6：F 5’-GCTTCG GCAGCACATATACTAAAAT-3’，R 5’-CGCTTCACG AATTTGCGTGTCAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度125 bp。Power SYBR Green PCR預(yù)混液混勻后置于ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-103a-3p的相對表達(dá)量。

1.7.4 Western blot檢測

取部分海馬組織，加入適量RIPA裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。煮沸變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。脫脂奶粉封閉，加入稀釋的BDNF、Tau、p-TauSer396、p-TauThr231和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。超敏ECL試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7.5 免疫組化檢測

取海馬組織石蠟切片，脫蠟至水。3%H2O2室溫封閉10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)后，加入山羊血清封閉15 min。加入稀釋的BDNF、Tau、p-TauSer396、p-TauThr231和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 差異microRNA篩選結(jié)果

GSE129053數(shù)據(jù)集共篩選出34個(gè)差異miRNA，其中17個(gè)上調(diào)、17個(gè)下調(diào)。同時(shí)，AD模型3個(gè)樣本中miR-103a-3p的表達(dá)均上調(diào)。結(jié)果見圖1、表1。

2.2 安神定志方對模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)和有效停留時(shí)間明顯減少，逃避潛伏期顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。與模型組比較，miR-103a-3p mimic組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)和有效停留時(shí)間明顯減少，逃避潛伏期顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；安神定志方組大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)和有效停留時(shí)間顯著增加，逃避潛伏期顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。而安神定志方對AD治療作用部分被miR-103a-3p mimic抵消，miR-103a-3p mimic＋安神定志方組大鼠逃避潛伏期較安神定志方組增加，跨越平臺(tái)次數(shù)和有效停留時(shí)間變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表2。

圖1 GSE129053數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)miRNA的火山圖和熱圖

表1 GSE129053數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)miRNA

表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.3 安神定志方對模型大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，無明顯病理改變；模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核皺縮、變??；miR-103a-3p mimic組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量進(jìn)一步減少，細(xì)胞膜與細(xì)胞核膜界線消失，胞質(zhì)染色變深；與模型組比較，安神定志方組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)明顯改善；miR-103a-3p mimic＋安神定志方組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)未見明顯改善。見圖2。

2.4 安神定志方對模型大鼠海馬組織miR-103a-3p表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，miR-103a-3p mimic組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.05），安神定志方組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.05），miR-103a-3p mimic＋安神定志方組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達(dá)略降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表3。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)組織形態(tài)（HE染色，×200）

表3 各組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.5 安神定志方對模型大鼠海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及Tau蛋白表達(dá)的影響

通過TargetScan網(wǎng)站（http://www.targetscan.org）預(yù)測miR-103a-3p的潛在靶基因，結(jié)果顯示，BDNF的3’-UTR與miR-103a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠海馬組織BDNF表達(dá)顯著降低，p-TauSer396和p-TauThr231表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，miR-103a-3p mimic組大鼠海馬組織BDNF表達(dá)顯著降低，p-TauSer396和p-TauThr231表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；安神定志方組大鼠海馬組織BDNF表達(dá)顯著升高，p-TauSer396和p-TauThr231表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），miR-103a-3p mimic＋安神定志方組海馬組織BDNF表達(dá)略增加，p-TauSer396和p-TauThr231表達(dá)略降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見圖3、表4。

此外，通過免疫組化染色進(jìn)一步檢測海馬組織BNDF及Tau蛋白的表達(dá)，通過Image J軟件對蛋白的平均光密度（IOD值）進(jìn)行半定量分析，結(jié)果與Western blot趨勢相同。同時(shí)，各組Tau蛋白表達(dá)未見明顯差異。結(jié)果見圖4、表5。

注：1.空白組；2.模型組；3. miR-103a-3p mimic組；4.安神定志方組； 5. miR-103a-3p mimic＋安神定志方組

表4 各組大鼠海馬組織BNDF及Tau蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

圖4 各組大鼠海馬組織BNDF及Tau蛋白陽性表達(dá)（免疫組化染色，×200）

表5 各組大鼠海馬組織BNDF及Tau蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

3 討論

miRNA是一類長度約為19～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，具有高度的保守性和組織特異性，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)分化和成熟具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，miRNA可直接或間接參與Aβ的代謝、Tau蛋白的磷酸化、神經(jīng)炎癥、膽固醇代謝、氧化應(yīng)激和軸突可塑性，進(jìn)而參與AD的發(fā)生與發(fā)展[8]。隨著基因芯片技術(shù)和RNA測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析為發(fā)現(xiàn)新的功能性miRNA提供了便利條件。本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取AD大鼠海馬組織中差異表達(dá)的miRNA，結(jié)果表明AD大鼠34個(gè)miRNA存在差異表達(dá)。本研究選取miR-103a-3p進(jìn)行進(jìn)一步研究。有研究證實(shí)，miR-103a-3p在腫瘤和子宮腺肌癥發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[9-14]，但關(guān)于miR-103a-3p在AD中的作用迄今尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，Aβ1-42誘導(dǎo)的AD模型大鼠海馬組織miR-103a-3p表達(dá)顯著上調(diào)，這與GSE129053芯片結(jié)果一致。本研究結(jié)果還表明，miR-103a-3p mimic尾靜脈注射可顯著升高海馬組織miR-103a-3p的表達(dá)，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和HE染色結(jié)果顯示，miR-103a-3p mimic可抑制AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，加重海馬神經(jīng)元的損傷。安神定志方能顯著抑制海馬組織miR-103a-3p的表達(dá)，從而促進(jìn)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)元損傷的修復(fù)，改善海馬組織形態(tài)。

BDNF是一種廣泛分布于海馬組織和大腦皮層的神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過在形態(tài)和功能上調(diào)控突觸的可塑性，進(jìn)而影響AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[15]。有研究顯示，AD患者血清和海馬組織BDNF表達(dá)顯著降低，并且BDNF水平與AD患者病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[16-17]。在神經(jīng)元中，BDNF通過與酪氨酸蛋白激酶受體B結(jié)合，激活MAPK、PI3K/Akt及PLC信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元的增殖、分化與存活[18]。課題組前期研究表明，BDNF是安神定志方治療AD的有效靶點(diǎn)，其可呈劑量依賴性增加AD大鼠海馬組織BNDF的表達(dá)。本研究通過TargetScan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)BDNF是miR-103a-3p的潛在靶基因。盡管本研究未通過熒光素酶報(bào)告基因檢測兩者之間的結(jié)合活性，但結(jié)合之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-103a-3p mimic能顯著抑制海馬組織BDNF的表達(dá)并干擾安神定志方對BDNF的調(diào)控作用。

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，主要分布于大腦顳葉、內(nèi)嗅區(qū)和海馬組織的神經(jīng)元。Tau蛋白的磷酸化主要發(fā)生在蘇氨酸和絲氨酸的殘基上，并在磷酸酯酶和磷酸激酶的調(diào)控下維持磷酸化和去磷酸化的平衡狀態(tài)[19]。研究表明，Tau蛋白異常磷酸化是AD的重要特征之一，同時(shí)直接影響Tau蛋白與微管結(jié)合的能力，最終導(dǎo)致原纖維絲的形成[20]。本研究通過Western blot和免疫組化檢測AD大鼠海馬CA1區(qū)Tau蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-103a-3p mimic顯著促進(jìn)Tau蛋白Ser396和Thr231位點(diǎn)的磷酸化，而安神定志方能顯著抑制p-TauSer396和p-TauThr231的表達(dá)，與前期研究結(jié)果一致。

綜上所述，安神定志方可能通過抑制miR-103a-3p的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)海馬組織BDNF的表達(dá)，調(diào)控Tau蛋白的磷酸化水平，從而促進(jìn)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

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Effects ofPrescription on miR-103a-3p and Its Mediated Phosphorylation of Tau Protein in Hippocampus of Alzheimer Disease Rats

WANG Xinbo1, ZHAO Yu1, YUAN Xingxing2

To investigate the effects ofPrescription on the levels of miR-103a-3p and Tau protein phosphorylation in hippocampus of Alzheimer disease (AD) rats; To discuss its related mechanism of action.Differentially expressed miRNAs in hippocampus of AD were screened by GEO database. 50 SD rats were randomly divided into control group, model group, miR-103a-3p mimic group,Prescription group and miR-103a-3p mimic combined withPrescription group, with 10 rats in each group. The AD rat model was established by intracerebroventricular injection of Aβ1-42. After modeling, each group was given corresponding drug intervention for 4 weeks. Morris water maze test was used to detect the learning and memory ability. HE staining was used to detect the morphological changes of hippocampus. The expression of miR-103a-3p was detected by RT-PCR. The expressions of BDNF and Tau protein in hippocampus were detected by Western blot and immunohistochemistry.A total of 34 miRNAs were screened by GEO database, 17 of which were up-regulated and 17 were down-regulated. Compared with the model group,Prescription could significantly increase the times of crossing platform and effective residence time, reduce escape latency, improve the tissue morphology of hippocampal CA1 area, up-regulate the expression level of BDNF, and inhibit the expression level of miR-103a-3p, p-TauSer396and p-TauThr231, with statistical significance (<0.05).Prescription may promote the expression of BDNF by inhibiting the expression of miR-103a-3p in hippocampus, and regulate the phosphorylation level of Tau protein, thereby promoting the learning and memory ability of AD rats.

Prescription; Alzheimer disease; GEO database; miR-103a-3p; Tau protein phosphorylation; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)02-0062-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202007309

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（H2018063）；黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（21102190005）

袁星星，E-mail：yuanxingxing80@163.com

（收稿日期：2020-07-15）

（修回日期：2020-08-10；編輯：華強(qiáng)）