王麗麗，林清霞，宋振碩，陳 林

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福州 350013)

黃酮類化合物廣泛存在于植物中，是重要的次生代謝產(chǎn)物之一。由于最先發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物都具有一個(gè)酮式羰基結(jié)構(gòu)，又呈黃色或淡黃色，故稱黃酮。黃酮類可看作是2-苯基色原酮的一系列衍生物，根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、三碳鏈?zhǔn)欠癯森h(huán)，B環(huán)連接位置可分為黃酮類和黃酮醇類、二氫黃酮類和二氫黃酮醇類、查爾酮類、雙黃酮類、異黃酮類以及其他黃酮類[1]。茶多酚是一類存在于茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]中的多元酚混合物，包括兒茶素類；黃酮、黃酮醇；花青素、花白素類；酚酸及縮酚酸等[2]。其中的兒茶素類屬黃烷-3-醇類，其含量約占茶多酚含量的70%，是茶葉中的特征性物質(zhì)和功能活性物質(zhì)，具有苦澀味，與茶湯濃度與滋味成正相關(guān)。茶葉中的黃酮類包括黃酮、黃酮醇及其苷類，其中黃酮醇C3位糖苷化后具有柔和感澀味(干燥的口感)，對茶湯中咖啡堿的苦味有增強(qiáng)作用，且對茶湯色澤有一定影響[3]。黃酮類和兒茶素類與茶葉感官品質(zhì)密切相關(guān)，而且具有諸多共同的生物活性，如抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠、降血脂、降血壓、護(hù)肝保肝、預(yù)防心腦血管疾病等[1-2,4]，因此受到研究人員的廣泛關(guān)注。

茶葉中黃酮類測定常采用三氯化鋁顯色法[5]，反應(yīng)原理是茶樣待測液與三價(jià)鋁鹽絡(luò)合后顯黃色。出境茶葉等植物源食品中黃酮類測定采用硝酸鋁顯色法[6]，利用的是待測液與鋁鹽在弱堿性條件生成黃色絡(luò)合物的原理。茶湯本底色澤尤其是綠茶、白茶和清香型烏龍茶的水提液顏色也顯黃(綠)色，故對上述顯色法產(chǎn)生一定干擾，導(dǎo)致測定值偏高。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法已用于測定檀香、柑橘醋、棗等多種植物中總黃酮含量[7-10]，但該法并不是黃酮類的專屬反應(yīng)，凡具有鄰苯二羥基的物質(zhì)均能用此法顯色測定[6]，因此測得的茶葉中總黃酮包括黃酮類和兒茶素類等。本試驗(yàn)用70%甲醇提取茶樣，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液顯色后生成紅色絡(luò)合物，于510 nm波長處測定吸光度，從而建立茶葉中總黃酮含量的分光光度法，并從精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率等方面進(jìn)行方法學(xué)考察。采用已建立的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶等4個(gè)茶類15個(gè)茶樣中總黃酮的含量。本試驗(yàn)建立了一種快速、較為準(zhǔn)確的用于茶葉中包括黃酮類和兒茶素在內(nèi)的總黃酮含量的測定方法，以期對茶葉感官品質(zhì)與功能活性評價(jià)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

綠茶樣(G1～G3)、烏龍茶樣(O1～O3)和紅茶樣(B1～B3)各3個(gè)，白茶樣(W1～W6)共6個(gè)，總計(jì)15個(gè)，生產(chǎn)年份均為2019年，市售，見表1。

表1 茶樣說明Table 1 Relevant information on sampled teas

1.2 試劑與儀器

試劑：甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和三氯化鋁(上海國藥，分析純)；蘆丁對照品[(成都曼思特生物科技有限公司，純度98%(UV)]；兒茶素(美國Sigma公司，純度>98%)；沒食子酸[阿拉丁(試劑)上海有限公司，純度>98%)]；福林酚試劑(北京索寶來)。

儀器：Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific)、ACD-502-U實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(重慶頤陽)、HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒)、普通96孔酶標(biāo)板(常德比克曼生物)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶樣供試液制備 稱取磨碎茶樣0.2 g，加入70%甲醇10 mL，70℃水浴提取20 min，期間振蕩1次。靜置30 min后轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，定容。再轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，4000 rpm離心10 min，取上清，即得供試液。

1.3.2 亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定總黃酮含量 參照張公亮[12]建立的方法，稍有改動(dòng)。取上述供試液1 mL于50 mL離心管中，加入5% 亞硝酸鈉 0.5 mL，搖勻，靜置6 min。然后加入10% 硝酸鋁 0.5 mL，搖勻，靜置6 min。最后加入4% 氫氧化鈉 4 mL，搖勻，靜置15 min。準(zhǔn)確移取200 μL至96孔板內(nèi)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用酶標(biāo)儀于510 nm波長下測吸光度，以70%甲醇作空白對照。

1.3.3方法學(xué)考察 分別從線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率等方面對1.3.2項(xiàng)下已建立的方法進(jìn)行方法學(xué)考察。(1)線性試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取蘆丁10 mg，用70%甲醇定容至10 mL容量瓶內(nèi)，超聲混勻，制得1 mg·mL-1儲(chǔ)備液。然后進(jìn)行系列稀釋后，制得0.2、0.4、0.5、0.6、0.8 mg·mL-1對照品溶液。取蘆丁對照品溶液1 mL，按1.3.2項(xiàng)下方法測定。以濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。(2)精密度試驗(yàn)：取W2磨碎茶樣0.2 g，按1.3.1項(xiàng)下方法制備供試液，按1.3.2項(xiàng)下方法顯色，96孔板中每孔加200 μL，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，測定吸光度，計(jì)算RSD。(3)重復(fù)性試驗(yàn)：取W2磨碎茶樣0.2 g，按1.3.1項(xiàng)下方法制備供試液，平行制備6份，其余同1.3.2項(xiàng)下操作，測定吸光度，計(jì)算RSD。(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)：將W2磨碎茶樣按1.3.1項(xiàng)下方法制備供試液，依1.3.2項(xiàng)下方法顯色。分別于顯色后的0、15、30、45、60、90 min時(shí)測定吸光度，計(jì)算RSD。(5)加標(biāo)回收率試驗(yàn)：W2茶樣按上述方法制備供試液，用純水按一定比例稀釋后作為待測液，按上述方法顯色后測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量(mg·mL-1)；同時(shí)取已知質(zhì)量濃度的蘆丁對照品溶液適量，加入待測液中，并控制其終體積為1 mL，顯色后測定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量；上述兩者差值的絕對值即為總黃酮增加量(mg·mL-1)?？傸S酮增加量與加入蘆丁濃度的比值即為加標(biāo)回收率。各回收率取平均值，計(jì)算RSD。

1.3.4 茶樣測定 分別準(zhǔn)確稱取15個(gè)茶樣磨碎樣0.2 g，按1.3.1項(xiàng)下方法制備供試液，用純水按1:5稀釋后作為待測液。取待測液1 mL，依1.3.2項(xiàng)下方法顯色，測定吸光度，代入線性回歸方程，得出總黃酮含量(%)。采用福林酚比色法[13]測定15個(gè)茶樣的茶多酚含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 21.0軟件進(jìn)行整理分析。表格和圖制作采用Excel 2010軟件，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉中幾種化合物與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉的顯色反應(yīng)特性

試驗(yàn)比較了蘆丁、兒茶素與沒食子酸等對照品與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液反應(yīng)后的顏色差異。從圖1看出，蘆丁和兒茶素與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色后均呈(鮮)紅色，W2茶樣與其顯色后為橙紅色，而沒食子酸顯色后為黃色。說明蘆丁和兒茶素結(jié)構(gòu)中的相同部位與亞硝酸鈉-硝酸鋁溶液發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)，當(dāng)加入4%氫氧化鈉后，絡(luò)合產(chǎn)物開環(huán)生成了2’-羥基查爾酮，從而使得兩者顯色一致，而沒食子酸與之反應(yīng)后未生成此物質(zhì)。W2茶樣中含有的兒茶素類、黃酮類等組分與之反應(yīng)后也呈橙紅色。因此采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測得的茶葉總黃酮包括黃酮類與兒茶素類。

圖1 不同樣品與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉的絡(luò)合顯色情況Fig.1 Colorization of tea methanol extracts reacted with NaNO2-Al(NO3)3-NaOH solution注：所用蘆丁、兒茶素和沒食子酸對照品溶液的質(zhì)量濃度依次為：0.3、0.5、1.0 mg·mL-1，茶樣為W2待測液。

2.2 方法學(xué)考察

以質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=1.2465X+0.0074，相關(guān)系數(shù)為0.9997。由此表明蘆丁對照品在0.2～1.0 mg·mL-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 蘆丁對照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rudin solutions

精密度試驗(yàn)表明，W2茶樣按1.3.1項(xiàng)下方法制備供試液，按1.3.2項(xiàng)下方法顯色后，測定吸光度，其吸光度的平均值為1.20，平均含量為0.95 mg·mL-1，RSD為0.94%。說明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)表明，W2茶樣按上述方法制備供試液，平行制備6份，其余操作不變，測得6份供試液的平均吸光度為1.22，平均含量為0.98 mg·mL-1，RSD為2.92%，說明該方法重復(fù)性好。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，W2茶樣依上述方法顯色后，0、15、30、45、60、90 min時(shí)測定吸光度依次為1.19、1.16、1.14、1.10、1.09、1.02，平均含量為0.89 mg·mL-1，RSD為4.82%。樣品顯色后在90 min 內(nèi)穩(wěn)定，表明該方法穩(wěn)定性良好。以上結(jié)果見表2。回收率試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，各加標(biāo)回收率為81.58%、83.04%、86.23%、80.95%、82.36%、91.95%。其平均值為84.35%，RSD為4.15%。

表2 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Precision, repeatability, and stability of proposed method

表 3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery rates of proposed method on spiked standards

2.3 茶樣總黃酮含量測定

15個(gè)茶樣分別采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法、福林酚比色法測定總黃酮和茶多酚含量，結(jié)果見圖3。從圖3可知，15個(gè)茶樣總黃酮含量范圍為5%～10%，平均值為8.22%，其中綠茶、白茶含量最高，烏龍茶次之，紅茶最低，推測含量大小主要與發(fā)酵程度有關(guān)。紅茶為全發(fā)酵茶，發(fā)酵程度高于其他茶類，因此測得總黃酮含量相對較低。W6系白茶中的壽眉等級，采用嫩梢或葉片制成，采摘原料相對白毫銀針、白牡丹等級較老，故其在6個(gè)白茶樣中含量也最低，僅為7.60%。測得茶多酚的含量范圍為7%～16%，平均值11.94%，與總黃酮含量規(guī)律表現(xiàn)基本一致，即：綠茶、白茶>烏龍茶>紅茶。雙變量相關(guān)性分析顯示，15個(gè)茶樣總黃酮含量與茶多酚含量呈極顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)達(dá)0.874。由此推測，茶葉中的總黃酮是茶多酚的主要組成物質(zhì)。

圖3 茶樣中總黃酮和茶多酚含量Fig.3 Contents of total flavonoids and tea polyphenols in teas as determined by different methods

3 討論與結(jié)論

蘆丁是黃酮醇化合物槲皮素的蕓香糖苷，是一種從植物中提取的黃酮類化合物。該化學(xué)物難溶于冷水，可溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。因此本試驗(yàn)參考《GB/T 8313-2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中茶多酚含量測定采用的提取溶劑，即用70%甲醇提取茶樣，目的是使茶樣中的總黃酮充分浸出。魯翠濤等[14]研究表明，50%～75%濃度的甲醇對千層塔干葉中總黃酮含量的提取率較高。

蘆丁是測定植物總黃酮含量常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在鐵觀音和云南普洱茶中也被檢測到[15-16]。亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法原理是先用亞硝酸鈉還原黃酮，再加硝酸鋁絡(luò)合，最后加氫氧化鈉溶液使黃酮類化合物開環(huán)，生成2’-羥基查耳酮而顯色。根據(jù)顯色之深淺(即吸光度值之大小)，判斷總黃酮含量之高低。本試驗(yàn)表明，茶葉中的兒茶素與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液反應(yīng)后生成2’-羥基查耳酮而顯紅色，但沒食子酸與之反應(yīng)后未生成此物質(zhì)，這與郭亞健等[17]研究結(jié)果一致，由此說明該顯色法測定的總黃酮包括黃酮類和兒茶素類，但不含沒食子酸。沒食子酸常作為福林酚比色法中測定茶多酚總量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[18]，原理是利用福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團(tuán)并顯藍(lán)色，于765 nm測定吸光度，用沒食子酸作校正標(biāo)曲定量茶多酚。15個(gè)茶樣中總黃酮含量為5%～10%，茶多酚含量7%～16%，二者呈極顯著正相關(guān)，由此推測，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測得的總黃酮與茶多酚之間具有密切相關(guān)性，茶葉的總黃酮是茶多酚的主要組成部分。

研究顯示，不同顯色方法適用于不同植物中黃酮類測定。田金河等[19]采用光譜掃描，三氯化鋁顯色、硝酸鋁顯色的方法分別測定綠豆殼中黃酮物質(zhì)的特征吸收峰，結(jié)果表明，采用低濃度三氯化鋁顯色的方法最適合綠豆殼中黃酮含量的測定。鐘世安等[5]采用三氯化鋁、硝酸鋁和氫氧化鉀作為顯色劑，對柚皮提取物中黃酮的特征吸收峰進(jìn)行測定比較，認(rèn)為硝酸鋁和氫氧化鉀顯色法適合測定柚皮提取物中黃酮含量。普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程中兒茶素含量有明顯降低，茶黃素和茶紅素的含量也不高，到壓制成成品茶時(shí)達(dá)到最低，因此郭剛軍等[18]認(rèn)為，普洱茶固態(tài)發(fā)酵樣與原料樣黃酮總量測定宜采用三氯化鋁法，而成品茶樣則宜采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法?？傊?，三氯化鋁顯色法對黃酮類化合物的專屬性較強(qiáng)，可用于茶葉黃酮類測定，但顯色不穩(wěn)定，且存在茶湯背景色干擾；而亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法較為穩(wěn)定，與茶葉中的黃酮類和兒茶素等均能絡(luò)合顯色，因此可測定二者總含量。然而該法回收率偏低，郭麗冰等[20]研究表明，以蘆丁為對照品，采用同樣方法測定降香總黃酮含量，加樣回收率低，為78.49%，可能原因是降香提取液在可見光下呈現(xiàn)深紅色，干擾測定結(jié)果，嘗試扣除背景后，結(jié)果仍不理想。降香中不含蘆丁，以降香中分離得到的一個(gè)含量較高的黃酮即柚皮素為對照品，與甲醇鈉顯色后測定410 nm吸光度，能較好的測定總黃酮含量，平均加標(biāo)回收率為100.46%。我們試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶湯稀釋液在510 nm幾乎無吸收，可忽略背景色干擾。在一定濃度范圍內(nèi)，茶湯稀釋液和蘆丁經(jīng)顯色后吸光度與其總黃酮含量分別呈線性關(guān)系，但茶湯與蘆丁混合后顯色不具有線性疊加特點(diǎn)，因此回收率結(jié)果不理想(偏低)，推測可能的原因是茶湯中如兒茶素類物質(zhì)與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉發(fā)生反應(yīng)后，其顯色程度(紅色深淺)與蘆丁顯色程度不一致，可考慮嘗試不同對照品測定茶葉中總黃酮含量。

本試驗(yàn)以蘆丁為對照品，采用70%甲醇提取茶樣，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液顯色后，于510 nm測定吸光度，從而建立了測定茶葉中總黃酮(包括黃酮類和兒茶素類)含量的分光光度法。該方法操作簡便，精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性好，可作為茶葉總黃酮含量測定的一種方法，用于茶葉品質(zhì)與活性評價(jià)。