杜 江，崔 云，蘇玉金，劉朝霞，徐作霖，熊志霞，李桂林

良性脊索腫瘤(benign notochordal cell tumour, BNCT)臨床比較少見，WHO(2013)骨及軟組織腫瘤中將其作為新分類腫瘤被收錄。BNCT和脊索瘤均被認(rèn)為起源于脊索組織，兩者在影像學(xué)、組織學(xué)及免疫組化染色上均有重疊[1]。有文獻報道[2]兩種腫瘤可共存，也有觀點認(rèn)為BNCT可以惡變?yōu)榧顾髁鯷3]，是脊索瘤的前期病變[4]。目前，脊索瘤拷貝數(shù)的變化表現(xiàn)為染色體1、2、3、5、6、7、9、10、13、14、17、20、22的變化[5]，但尚缺乏關(guān)于BNCT拷貝數(shù)變化的研究。OncoScan全基因組拷貝數(shù)分析可用于福爾馬林固定的石蠟包埋標(biāo)本，其敏感性和特異性較高[6]，可用于分析腫瘤組織的拷貝數(shù)變化。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集2009年5月1日～2013年4月31日北京市神經(jīng)外科研究所神經(jīng)病理室診斷的1例BNCT，腫瘤復(fù)發(fā)2次，最終惡變?yōu)榻?jīng)典型脊索瘤。該患者男性，38歲，腫瘤位于鼻咽部、斜坡骨質(zhì)和鞍區(qū)。第1次行近腫瘤完整切除，術(shù)后病理診斷為BNCT，5個月后復(fù)發(fā)，行部分切除，術(shù)后病理仍診斷為BNCT。40個月后，患者再次復(fù)發(fā)，術(shù)后病理診斷為經(jīng)典型脊索瘤。標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師進行診斷。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 免疫組化染色采用EnVision兩步法，pH 8.0 EDTA高壓鍋抗原修復(fù)。一抗采用單克隆抗體工作液[vimentin、CK(AE1/AE3)、CK8/18、EMA、p53、S-100蛋白和Ki-67核抗原]。一抗采用單克隆抗體Brachyury蛋白(稀釋比1 ∶500，Abcam公司，英國)，所有工作液的試劑均購自Invitrogen公司(格蘭德艾蘭公司，美國)，并應(yīng)用SuperPicture 3rd Gen免疫組化檢測試劑盒。本實驗分別設(shè)立陰、陽性對照，陽性為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈棕黃色顆粒；陰性為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核未出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.2.2OncoScan拷貝數(shù)分析 基因組DNA的提取來自于4 μm厚的石蠟包埋組織切片，經(jīng)病理組織學(xué)證實為腫瘤實質(zhì)部分。DNA提取：采用Qiagen DNA石蠟包埋組織試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, Qiagen, 56404)。用Qubit分光光度計和NANODROP分光光度計分別測定DNA的濃度和純度。DNA吸收比A260/A280在1.8～2.0之間，最小濃度為12 ng/μL，總質(zhì)量為80 ng判定為合格樣本，每份樣本以80 ng腫瘤組織DNA進行分析，采用Mip探針，應(yīng)用OncoScan檢測進行全基因組拷貝數(shù)分析。樣本分析過程依據(jù)Affymetrix使用說明書。檢測后生成的文件通過OncoScan Console軟件(Biodiscovery有限公司，加利福尼亞州，美國)和OncoScan Nexus Express軟件3.0版本(Biodiscovery有限公司，加利福尼亞州，美國)進行轉(zhuǎn)換和分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床及影像學(xué)特點患者男性，首次發(fā)病年齡38歲，臨床表現(xiàn)為頭痛5個月，隨后出現(xiàn)聽力下降2個月。MRI檢查示腫瘤大小5.7 cm×4.2 cm×6.6 cm，位于鼻咽部、斜坡骨質(zhì)和鞍區(qū)。病灶表現(xiàn)為T1低信號(圖1A)和T2高信號，且有不規(guī)則增強。行內(nèi)鏡下鞍區(qū)腫瘤切除術(shù)，近完整切除，鼻竇內(nèi)有少量殘留。術(shù)后未采取放療。5個月后患者出現(xiàn)鼻塞，再次行經(jīng)蝶內(nèi)鏡下鞍區(qū)腫瘤切除術(shù)。40個月后，經(jīng)復(fù)查發(fā)現(xiàn)腫瘤增大?；颊咦笱弁庹故芟薨閺?fù)視8個月，左側(cè)咀嚼無力2個月，MRI檢查顯示T1低信號，T2高信號，手術(shù)區(qū)域的邊緣出現(xiàn)明顯的對比增強(圖1B)。術(shù)后行放療，24個月時隨訪未見患者復(fù)發(fā)。

圖1 A.第1次BNCT術(shù)前MRI檢查示腫瘤大小5.7 cm×4.2 cm×6.6 cm，位于鼻咽部、斜坡骨質(zhì)和鞍區(qū)，T1低信號；B.第3次手術(shù)切除脊索瘤，術(shù)前MRI檢查示手術(shù)邊緣部位，腫瘤再生長，T1出現(xiàn)明顯對比增強

2.2 病理特征第1次術(shù)后標(biāo)本，病理診斷為BNCT。鏡下見腫瘤缺乏細(xì)胞外基質(zhì)，瘤細(xì)胞空泡狀，細(xì)胞核位于邊緣部，無核分裂象(圖2A)。第2次術(shù)后標(biāo)本鏡下顯示腫瘤的絕大部分形態(tài)仍然為BNCT，僅偶見胞質(zhì)嗜酸的腫瘤細(xì)胞。第3次術(shù)后標(biāo)本鏡下顯示絕大部分的腫瘤組織學(xué)形態(tài)為經(jīng)典型脊索瘤。腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)空亮或嗜酸，條索狀排列，周圍有豐富的黏液樣間質(zhì)(圖2B)。此外，仍有部分區(qū)域表現(xiàn)BNCT的特征，但該區(qū)域的空泡細(xì)胞密度有所增加，并且空泡細(xì)胞大小不一，腫瘤細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。

2.3 免疫表型BNCT中Brachyury呈局灶陽性，脊索瘤中Brachyury呈彌漫強陽性(圖2C)。Ki-67增殖指數(shù)為10%(圖2D)。3次手術(shù)標(biāo)本中的CK、CK8/18、EMA、vimentin、S-100、p53表達無差異(表1)。

圖2 A.第1次術(shù)后標(biāo)本，鏡下見BNCT無細(xì)胞外黏液樣基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞空泡狀，核位于周邊部，類似于成熟的脂肪細(xì)胞；B.第3次術(shù)后標(biāo)本，鏡下見經(jīng)典型脊索瘤結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸，條帶狀分布于豐富的黏液樣基質(zhì)中；C.第3次術(shù)后標(biāo)本免疫組化標(biāo)記Brachyury彌漫強陽性，EnVision兩步法；D.第3次術(shù)后標(biāo)本Ki-67增殖指數(shù)為10%，可見陽性的異型細(xì)胞，EnVision兩步法

表1 BNCT及其向脊索瘤轉(zhuǎn)化標(biāo)本中蛋白免疫表型

2.4 OncoScan檢測第1次手術(shù)切除的BNCT標(biāo)本及第3次手術(shù)切除的脊索瘤標(biāo)本分別進行OncoScan檢測，兩次檢測結(jié)果存在一些差異性的拷貝數(shù)變化(圖3)。

本例BNCT和脊索瘤同時存在一些拷貝數(shù)的獲得，主要包括：1q21.1-q44、6q11.1-q27、7p22.3-q36.3、12p12.3-q24.13、12q24.2-24.33、16p12.3。另外，脊索瘤特有的拷貝數(shù)丟失區(qū)域包括：3p25.3-p25.2、3p22.3-p22.2、3p21.31-p12.3、3p12.3-q11.1、3q11.2、3q13.2-q25.1、3q26.1、3q26.33-q27.2、9q21.32-q21.33、21q21.2、21q21.3、21q22.12-q22.3。另外有9p的雜合性缺失，包括9p24.3-p22.3、9p22.1-p21.2、9p21.1-p13.1。

3 討論

本例BNCT惡變?yōu)榻?jīng)典型脊索瘤的病例為國內(nèi)首次報道，也是首次對BNCT惡變病例進行了全基因組拷貝數(shù)的檢測。BNCT被WHO(2013)骨及軟組織腫瘤分類所收錄[7]，其與脊索瘤的起源相同，預(yù)后較好，應(yīng)與脊索瘤區(qū)分。但有文獻報道，BNCT可以向脊索瘤轉(zhuǎn)化[3]，也有非典型BNCT的報道，提示BNCT和脊索瘤的成分可以混合存在[2]。

BNCT中MRI檢查示T1低信號和T2高信號，與脊索瘤相同，但脊索瘤顯示T1對比增強[8]，而大部分BNCT無對比增強[3]。本例惡變?yōu)榧顾髁鰳?biāo)本MRI檢查示明顯的對比增強。

組織學(xué)上BNCT最主要的特征是缺乏細(xì)胞外黏液樣間質(zhì)，腫瘤細(xì)胞空泡樣[9]。無非典型性，無核分裂和壞死。脊索瘤則為黏液樣間質(zhì)中散在條索樣的腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)透明或嗜伊紅。腫瘤細(xì)胞可顯示不同程度的非典型性，可見核分裂象和壞死[7]。隨著腫瘤的復(fù)發(fā)，本例組織病理學(xué)特征顯示從BNCT到脊索瘤的轉(zhuǎn)變。免疫組化染色示BNCT中Ki-67增殖指數(shù)約1%，而脊索瘤中Ki-67增殖指數(shù)高達10%，這也提示了腫瘤的惡性進展。Brachyury基因位于6q27，是脊索組織分化過程中重要的T基因轉(zhuǎn)錄因子，屬于T基因家族成員，其可以調(diào)控下游多個信號通路，構(gòu)成分子網(wǎng)絡(luò)[10]。在Miettinen等[11]的研究中，53例脊索瘤中Brachyury蛋白均陽性，目前認(rèn)為其是脊索瘤高度特異的標(biāo)志物，有助于脊索瘤與其它間胚葉來源的腫瘤鑒別，包括軟骨肉瘤。在本例脊索瘤中Brachyury顯示為彌漫陽性，BNCT中為局灶陽性，部分區(qū)域陰性。Shen等[12]報道Brachyury在脊索瘤中陽性，但在脊索瘤周邊的BNCT區(qū)域則為陰性，并且在胎兒脊索細(xì)胞巢(notochordal cell rests, NCR)中陰性，在組織學(xué)上胎兒NCR與BNCT形態(tài)相似，提示在BNCT中Brachyury陰性區(qū)域可能與NCR有關(guān)。脊索瘤通常具有較低的突變率，是C類(染色體拷貝數(shù)變化)腫瘤，其致癌特征是非隨機多重拷貝數(shù)丟失[13]。本實驗OncoScan全基因組拷貝數(shù)分析顯示BNCT中拷貝數(shù)的獲得更常見。在惡變?yōu)榧顾髁鰰r，則出現(xiàn)比較大片段的拷貝數(shù)缺失，這與一些脊索瘤的文獻報道一致，即脊索瘤易表現(xiàn)為拷貝數(shù)的缺失[14]。但本例同時保留BNCT拷貝數(shù)獲得的特點，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)3p、3q的大片段缺失和9p、9q、21q的部分缺失。一些研究認(rèn)為脊索瘤的進展可能依賴于拷貝數(shù)丟失介導(dǎo)的分子機制[13,15]。本組在3號染色體的大片段缺失涉及的主要基因包括：SRGAP3、FANCD2、VHL、PPARG、RAF1、XPC、MLH1、MYD88、CTNNB1、SETD2、BAP1、PBRM1、FHIT、MITF、FOXP1、CBLB、GATA2、RPN1、FOXL2、WWTR1、GMPS、MLF1、EVI1、PIK3CA、SOX2、ETV5、BCL6、LPP、TFRC。曾有研究認(rèn)為脊索瘤出現(xiàn)拷貝數(shù)變化可能與以下原因有關(guān)，在3p21.1-p21.31處的8 Mb段內(nèi)，3個癌癥相關(guān)染色質(zhì)重塑和推測的抑癌基因位于此處，為SETD2、BAP1和PBRM1基因[13]。在作者觀測的BNCT惡變病例中，也出現(xiàn)了這一區(qū)段的缺失，導(dǎo)致上述基因的缺失。本例BNCT惡變病例中，出現(xiàn)3號染色體多個片段的丟失則與Szuhai等[15]報道一致，認(rèn)為3號染色體的丟失是脊索瘤發(fā)生中的早期事件。

圖3 第1次手術(shù)切除樣本和第3次手術(shù)切除樣本的OncoScan染色體拷貝數(shù)分析：A.BNCT樣本主要顯示1、6、7、12、16、17號染色體的拷貝數(shù)獲得；B.脊索瘤樣本顯示增加了大片段的3號、21號染色體和部分9號染色體的拷貝數(shù)缺失；0基線上方線段為拷貝數(shù)獲得染色體片段，基線下方線段為拷貝數(shù)缺失片段

9號染色體的缺失片段基因包括JAK2、CD274、NFIB、MLLT3、FANCG、PAX5、CDKN2A、CDKN2B，其中CDKN2A/B已經(jīng)在多種腫瘤中證實與患者預(yù)后不良相關(guān)，在脊索瘤的研究中也有報道[16]。

本例脊索瘤標(biāo)本中出現(xiàn)染色體3p、3q的缺失和9p雜合性缺失，提示其可能是脊索瘤發(fā)生的早期事件。同時，也提示BNCT可以惡變?yōu)榧顾髁觯P(guān)于3p、3q、9p的缺失在脊索瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制尚待進一步分析，可能與其導(dǎo)致眾多基因缺失促進了腫瘤的增殖有關(guān)。