陳璨，韓南南，劉洋，史曉維，司紅起，馬傳喜

小麥位點基因拷貝數(shù)的變異分析

陳璨，韓南南，劉洋，史曉維，司紅起，馬傳喜

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮南部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，合肥 230036

【】基因拷貝數(shù)變異是一種常見又重要的基因結(jié)構(gòu)變異，往往影響個體表型。低分子量麥谷蛋白（low-molecular-weight glutenin subunit，LMW-GS）是小麥貯藏蛋白的主要組成部分，位于位點。小麥作為異源六倍體，其龐大且復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)導(dǎo)致難以利用傳統(tǒng)方法檢測目的基因的拷貝數(shù)，針對小麥基因組，篩選可靠穩(wěn)定的內(nèi)參基因和體系，探索適合復(fù)雜基因組的拷貝數(shù)變異測定技術(shù)，測定位點LWM-GS基因拷貝數(shù)。以為內(nèi)參基因，根據(jù)基因序列設(shè)計內(nèi)參引物和探針，通過定性和定量PCR測定內(nèi)參基因在12個普通小麥品種中的拷貝數(shù)，分析該基因拷貝數(shù)在不同品種間的穩(wěn)定性；又以小麥品種篙優(yōu)2018的5個稀釋濃度的基因組DNA為模板，利用qRT-PCR驗證內(nèi)參系統(tǒng)的重復(fù)性和準確性；根據(jù)位點LMW-GS基因序列設(shè)計特異性引物及探針，利用qRT-PCR和ddPCR 2種方法檢測8個小麥品種位點基因拷貝數(shù)，比較后選擇更優(yōu)的高通量基因拷貝數(shù)檢測方法；再根據(jù)和位點LMW-GS基因序列設(shè)計相應(yīng)的特異性引物及探針，并利用ddPCR技術(shù)檢測和分析了231份小麥品種的、和位點上LMW-GS基因拷貝數(shù)。在12個普通小麥品種間、同一品種5個DNA稀釋濃度間的拷貝數(shù)測定結(jié)果一致，技術(shù)重復(fù)間的變異系數(shù)僅為0.07%—0.77%，所構(gòu)建的內(nèi)參系統(tǒng)穩(wěn)定；比較qRT-PCR和ddPCR 2種拷貝數(shù)檢測方法，8個品種所測的位點拷貝數(shù)結(jié)果一致，分別為3、5、3、4、3、3、3和3；且ddPCR檢測重復(fù)間的變異系數(shù)為0.30%—1.67%，遠低于qRT-PCR的3.14%—12.72%，更加可靠；利用ddPCR對231份普通小麥品種的、和位點上LMW-GS基因拷貝檢測后分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)小麥品種在3個位點上的拷貝數(shù)為4，所占頻率分別為51.95%、32.03%和28.57%，位點總拷貝數(shù)變異范圍為10—21，變異系數(shù)為16.12%。內(nèi)參系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可以用作小麥位點和其他目的基因拷貝數(shù)檢測的內(nèi)參；qRT-PCR和ddPCR均可用于小麥基因拷貝數(shù)的檢測，但后者更穩(wěn)定、可靠，且操作簡單、檢測通量高。

小麥；低分子量麥谷蛋白；微滴式數(shù)字PCR；拷貝數(shù)變異

0 引言

【研究意義】小麥低分子量麥谷蛋白（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS）約占貯藏蛋白的1/3[1]，其組成和結(jié)構(gòu)對小麥面粉品質(zhì)具有重要影響，尤其是面團面筋強度，并決定面團的粘彈性[2-3]。研究表明，LMW-GS的編碼基因大部分定位于小麥第一同源群染色體1A、1B和1D短臂近端粒處，依次被命名為、和位點，每個位點都包含著多個LMW-GS基因，構(gòu)成了非常復(fù)雜的LMW-GS基因家族[4-6]。LMW-GS基因的組成、拷貝數(shù)及其表達情況都影響著小麥品質(zhì)性狀[7-9]。但由于LMW-GS基因組成復(fù)雜，目前缺少有效的分離方法，很大程度上限制了對其拷貝數(shù)的研究。因此，探索和構(gòu)建高通量檢測拷貝數(shù)變異的方法尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】基因的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）是一種常見而又重要的基因結(jié)構(gòu)變異，一般認為是由染色體重排等染色體結(jié)構(gòu)變異引起的，會導(dǎo)致基因組遺傳不穩(wěn)定，對個體性狀會產(chǎn)生一定的影響[10-11]。對于拷貝數(shù)的檢測，常用的技術(shù)主要包括實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、Sothern印跡雜交（southern blot）、短片段多重定量PCR（quantitative multiplex PCR of short fragments，QMPSF）以及數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)。20世紀末，Vogelstein等[12]提出了dPCR的概念，即將有限稀釋法、泊松分布和PCR技術(shù)聯(lián)合使用的新方法[13-14]。一種新的dPCR分析系統(tǒng)——微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR），用于檢測目的基因的拷貝數(shù)，可以使用熒光探針對2個靶基因同時進行檢測，先使用微滴生產(chǎn)儀將一個樣本分成幾萬份（>10 000），分配到不同的微滴單元，每個單元包含一個或多個拷貝數(shù)的目標分子（DNA模板），在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后利用微滴分析儀對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析，最后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度[15-16]。在利用ddPCR進行基因拷貝數(shù)檢測時需要一個已知的單拷貝或低拷貝基因作為內(nèi)參基因，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）是植物脂肪酸生物合成中的一種限速酶[17-19]。在禾本科作物基因組中，同時含有編碼質(zhì)體ACCase（）和胞質(zhì)ACCase（）的基因[20-21]，其中，被定位于2A、2B和2D染色體靠近端粒的短臂上，且Southern印跡雜交試驗表明普通小麥中在每個染色體組都是單拷貝[22]。因此，可以作為檢測小麥中其他基因拷貝數(shù)的內(nèi)參基因。【本研究切入點】由于六倍體小麥為異源多倍體作物，其基因組龐大且復(fù)雜，利用傳統(tǒng)的Sothern印跡雜交等技術(shù)檢測小麥基因拷貝數(shù)費時費力，并且無法達到高通量測定要求?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬選擇適當內(nèi)參基因，通過ddPCR技術(shù)構(gòu)建一種高通量、快速且穩(wěn)定的小麥基因拷貝數(shù)測定方法；并通過構(gòu)建的內(nèi)參體系和方法測定普通小麥位點LMW-GS基因拷貝數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

231份不同品種六倍體小麥秋播于合肥高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園試驗站，每個材料種植2行，行長2 m，行距25 cm，田間管理同大田管理。

1.2 內(nèi)參的選擇

構(gòu)建可靠的CNV檢測方法需要選擇特異性的DNA序列作為內(nèi)參基因，并且需要滿足3個要求：具有物種特異性，具有單個或穩(wěn)定的低拷貝數(shù)，以及不同品種之間拷貝數(shù)相同[23-24]。通過查閱文獻，選擇作為內(nèi)參基因，從NCBI網(wǎng)站上下載已知序列，在保守區(qū)域設(shè)計引物和探針，構(gòu)建內(nèi)參系統(tǒng)。

1.3 定性PCR條件

采用全式金生物公司的TransTaq?Hifi酶在T100TMThermal Cycler （BIO-RAD Laboratories，USA）熱循環(huán)儀進行定性PCR分析，反應(yīng)體系為2.0 μl樣本DNA、0.5 μl上游引物（10 μmol·L-1）、0.5 μl下游引物（10 μmol·L-1）、2.0 μl dNTPs（2.5 mmol·L-1）、2.5 μl 10×Buffer、0.25 μl DNA酶，補加ddH2O至25 μl。PCR擴增程序為95℃ 5 min；95℃ 50 s，50—65℃ 30 s，72℃ 30s，40個循環(huán)；72℃ 10min；4℃保存。擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4 定量PCR條件

qRT-PCR采用愚公生命科技有限公司的Taq-HS Probe qPCR Premix，在CF×96TMReal-Time System（BIO-RAD Laboratories，USA）中進行，反應(yīng)體系為2.0 μl樣本DNA、1.0 μl上游引物（10 μmol·L-1）、1.0 μl下游引物（10 μmol·L-1）、1.0 μl探針（10 μmol·L-1）和1.25 μl Taq-HS Probe qPCR Premix（10×），補加ddH2O至25 μl。qPCR擴增程序為95℃ 3 min；95℃ 30 s，50—65℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；在每個循環(huán)的延伸階段采集熒光信號。參考Weng等[25]報道的絕對定量法來計算不同品種中目的基因拷貝數(shù)。

1.5 基因組DNA的酶切處理

采用NEB公司的HⅠ限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進行酶切處理，50 μl的反應(yīng)體系包含1 μg基因組DNA、1 μlHⅠ限制性內(nèi)切酶和5 μl 10×NE Buffer，補加ddH2O至50 μl。在37℃恒溫條件下反應(yīng)5 h，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 微滴式數(shù)字PCR分析基因拷貝數(shù)

先配制20×目的基因（或內(nèi)參基因）引物/探針混合液，包含目的基因（或內(nèi)參基因）上、下游引物（100 μmol·L-1）各18 μL和目的基因（或內(nèi)參基因）探針（100 μmol·L-1）5 μL，補加ddH2O至100 μL。再采用BIO-RAD公司的ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）制備ddPCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為10 μL 2×ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）、1 μL 20×目的基因引物/探針混合液、1 μL 20×內(nèi)參基因引物/探針混合液和30 ng酶切后基因組DNA，補加ddH2O至20 μL。

隨后將反應(yīng)液通過QX200TM微滴發(fā)生器（QX200TMDroplet Generator, BIO-RAD Laboratories，USA）生成納升級別的油包水的液滴（理論上可形成20 000個微滴），緊接著轉(zhuǎn)移到96孔PCR板（Eppendorf, Germany）中，并利用熱封儀（PX1TMPCR Plate Sealer, BIO-RAD Laboratories，USA）進行封膜。然后轉(zhuǎn)移到T100TMThermal Cycler（BIO-RAD Laboratories，USA）上進行PCR擴增，擴增程序為95℃ 10 min；94℃ 30 s；50—65℃ 1 min，40個循環(huán)；98℃ 10 min；4℃保存待用，升降溫速度為2.0 ℃·s-1。

PCR擴增完成后，將其轉(zhuǎn)移到QX200TM微滴分析儀（QX200TMDroplet Reader, BIO-RAD Laboratories，USA）對所有樣品孔進行熒光檢測。最后利用QuantaSoft軟件（V1.3.10）對ddPCR數(shù)據(jù)進行分析，計算每個樣品目的基因拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)參基因的選擇及其引物與探針的設(shè)計

通過查閱文獻搜索到低拷貝數(shù)的候選基因質(zhì)體乙酰輔酶A羧化酶基因（），在普通小麥中具有3個拷貝。從NCBI網(wǎng)站上下載已公布的序列，運用DNAMAN生物軟件對下載的序列進行序列對比，運用Primer express3.0軟件在的保守區(qū)域設(shè)計引物（Acc1F和Acc1R）和探針（T-Acc1）（表1）。

表1 特異性引物和探針

2.2 定性和定量PCR檢測Acc1在不同六倍體小麥中的穩(wěn)定性

合適的內(nèi)參基因應(yīng)在同一物種的不同品種之間具有相同的拷貝數(shù)，為了檢測不同普通小麥品種之間拷貝數(shù)的種內(nèi)穩(wěn)定性，選取12個品種的普通小麥提取基因組DNA，每個品種各取30 ng DNA，以Acc1F、Acc1R為引物進行定性PCR擴增，結(jié)果表明，不同品種之間獲得相同大小和等效強度的PCR產(chǎn)物，并且沒有顯示出非特異性的條帶（圖1），表明所設(shè)計的引物能夠穩(wěn)定地擴增出序列，特異性較高，并且普通小麥品種間拷貝數(shù)沒有明顯差異。

1：黔11240-2；2：鄭麥583；3：中麥14；4：德宏福麥2號；5：瑞泉麥168；6：中合-75；7：益科麥5號；8：內(nèi)麥836；9：陽光838；10：安農(nóng)1020；11：新麥31；12：黔090304-4

選取12個不同品種小麥50 ng基因組DNA，以Acc1F、Acc1R為引物，T-Acc1為探針進行實時熒光定量PCR，定量PCR的結(jié)果顯示不同品種的小麥擴增曲線極為相似，并且獲得的Ct值只有輕微的變異性（圖2），范圍為29.18—30.00，變異系數(shù)為1.03%，拷貝數(shù)在供試品種之間被認為是相同的。

2.3 定量PCR檢測Acc1定量系統(tǒng)的重復(fù)性

為了進一步驗證定量系統(tǒng)的準確性，選用篙優(yōu)2018的5個稀釋度的基因組DNA為模板，以Acc1F、Acc1R為引物，T-Acc1為探針進行定量PCR（表2），結(jié)果表明，復(fù)孔間變異系數(shù)為0.07%—0.77%，SD值為0.0208—0.2100，由于這些值相對較小，因此，定量系統(tǒng)被認為是穩(wěn)定且可靠的，可作為內(nèi)參基因來測定其他基因的拷貝數(shù)。

2.4 Glu-3位點LMW-GS基因的引物與探針設(shè)計及其特異性分析

從NCBI網(wǎng)站上下載已知的分別位于、和位點上的LMW-GS基因，通過對LMW-GS基因序列進行比對，并設(shè)計相應(yīng)的特異性引物與探針（表1），其中，Glu-A3T、Glu-B3T和Glu-D3T探針的5′端、3′端所連的熒光集團分別為5′-FAM和3′-BHQ1；T-Acc1探針的5′端、3′端所連的熒光集團分別為5′-HEX和3′-BHQ1。

A：12個不同品種的內(nèi)參基因定量PCR擴增曲線；1：黔11240-2；2：鄭麥583；3：中麥14；4：德宏福麥2號；5：瑞泉麥168；6：中合-75；7：益科麥5號；8：內(nèi)麥836；9：陽光838；10：安農(nóng)1020；11：新麥31；12：黔090304-4。B：12個不同普通小麥品種的Ct值

表2 內(nèi)參基因重復(fù)性檢測Ct值變化情況

從普通小麥近緣物種（烏拉爾圖小麥AA、一粒小麥AA、擬斯卑爾脫山羊草BB、節(jié)節(jié)麥DD和圓錐小麥AABB）及普通小麥AABBDD中國春、安農(nóng)0711中提取基因組DNA，分別用引物Glu-A3F/R、Glu-B3F/R、Glu-D3F/R進行PCR擴增，結(jié)果顯示，Glu-A3F/R只能從含A基因組的材料中擴增出目的基因，Glu-B3F/R只能從含有B基因組的材料中擴增出目的基因，Glu-D3F/R只能從含D基因組的材料中擴增出目的基因（圖3）。

2.5 2種拷貝數(shù)變異分析方法的比較

qRT-PCR與ddPCR均能對目的基因拷貝數(shù)進行測定，選用8個普通小麥品種，分別采用qRT-PCR和ddPCR 2種方法來測定普通小麥位點上的LMW-GS基因拷貝數(shù)。

以煙農(nóng)19全基因組DNA（1 066.71 ng·μL-1）為模板，稀釋成6個梯度，進行qRT-PCR反應(yīng)；以水作為空白對照，得出Ct值與DNA初始濃度的對數(shù)值之間的標準曲線（圖4），并得到內(nèi)參基因的標準曲線方程（=-2.780+33.098，2=0.998，E=106.1%）和目的基因的標準曲線方程（=-2.823+33.993，2=0.998，E=108.9%），這兩個基因擴增曲線的相關(guān)系數(shù)（2）均接近1，且擴增效率（E）也均接近于1，表明所構(gòu)建的標準曲線可以用于拷貝數(shù)的測定。

選取8個小麥品種的基因組DNA（濃度均為200 ng·μL-1），進行qRT-PCR反應(yīng)，每個樣品3次重復(fù)，并且與繪制標準曲線的樣品同時擴增，擴增結(jié)束后得到8個樣品的Ct值（表3），結(jié)果顯示，8個小麥品種中拷貝數(shù)最高為5，最低為3，有6個品種的拷貝數(shù)為3，并且利用qRT-PCR測定時重復(fù)間的變異系數(shù)為3.14%—12.72%。

A：Glu-A3F/R引物檢測。1：中國春；2：一粒小麥；3：擬斯卑爾托山羊草；4：節(jié)節(jié)麥；5：烏拉爾圖小麥；6：水；7：安農(nóng)0711。B：Glu-B3F/R引物檢測。1：一粒小麥；2：節(jié)節(jié)麥；3：圓錐小麥；4：中國春；5：水。C：Glu-D3F/R引物檢測。1：烏拉爾圖小麥；2：擬斯卑爾托山羊草；3：節(jié)節(jié)麥；4：圓錐小麥；5：水

表3 8個不同樣品3次重復(fù)的Ct值及目的基因拷貝數(shù)變化情況

圖4 目的基因和內(nèi)參基因標準曲線

采用ddPCR來測定上述8個不同小麥品種的拷貝數(shù)。限制性內(nèi)切酶HⅠ酶切基因組DNA（濃度為200 ng·μL-1）后，再按照ddPCR操作步驟進行試驗，最后得出了8個品種的拷貝數(shù)測定結(jié)果（圖5），其中，安農(nóng)92484W拷貝數(shù)最高為5，小偃6號拷貝數(shù)為4，其余6個品種的拷貝數(shù)為3，且重復(fù)間的變異系數(shù)僅在0.30%—1.67%。

綜上所述，利用qRT-PCR和ddPCR 2種方法對8個樣品目的基因拷貝數(shù)的檢測結(jié)果是一致的，但是ddPCR重復(fù)間的變異系數(shù)要遠低于qPCR，表明用ddPCR方法來測定基因拷貝數(shù)更穩(wěn)定、準確。

1：煙農(nóng)15；2：安農(nóng)92848W；3：百農(nóng)64；4：小偃6號；5：周麥16；6：02P67；7：邯鄲6172；8：周麥18

2.6 微滴式數(shù)字PCR測定普通小麥Glu-3位點LMW-GS拷貝數(shù)

利用微滴式數(shù)字PCR對231份不同品種的普通小麥的、和位點LMW-GS基因分別進行拷貝數(shù)檢測（電子附表1），對檢測結(jié)果進行了統(tǒng)計分析（圖6），結(jié)果顯示，在231份材料中，大多數(shù)小麥品種的位點LMW-GS基因拷貝數(shù)為4，所占頻率51.95%，最高拷貝數(shù)為8，最低為3，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為28.40%；大多數(shù)小麥品種的位點LMW-GS基因拷貝數(shù)為4，所占頻率為32.03%，拷貝數(shù)最高為9個拷貝，最低為3個拷貝，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為29.30%；大多數(shù)小麥品種的位點LMW-GS基因拷貝數(shù)為4，所占頻率為28.57%，拷貝數(shù)最高為9個拷貝，最低為3個拷貝，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為30.07%。

綜合、和3個位點的LMW-GS基因拷貝數(shù)測定結(jié)果，可以計算出小麥位點基因的總拷貝數(shù)（圖7）。結(jié)果顯示，在231份材料中，大多數(shù)小麥品種的位點LMW-GS基因拷貝數(shù)為12—18，所占頻率為85.90%，拷貝數(shù)最高為21，最低為10，不同品種間拷貝數(shù)變異系數(shù)為16.10%。

圖6 231份小麥品種Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位點基因拷貝數(shù)頻數(shù)分布條形圖

圖7 231份小麥品種Glu-3位點基因拷貝數(shù)頻數(shù)分布條形圖

3 討論

微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展起來的第三代PCR技術(shù)，已被越來越多地應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，比如致病微生物檢測[26]、稀有突變檢測[27]、基因表達分析[28]、基因拷貝數(shù)變異分析[29]等。在利用ddPCR來測定目的基因拷貝數(shù)時需要一個已知拷貝數(shù)的單拷貝或低拷貝基因作為內(nèi)參基因。一些研究以單拷貝的、和作為內(nèi)參基因來檢測轉(zhuǎn)基因小麥外源基因拷貝數(shù)[30]。而本研究所選擇的內(nèi)參基因為質(zhì)體乙酰輔酶A羧化酶（plastid ACCase）基因（）。Gornicki等[31]利用中國春缺四體材料將定位在了第二同源群2A、2B和2D染色體靠近端粒的短臂上，并利用Southen印跡雜交分析得出六倍體小麥中在每個染色體組都為單拷貝，因此，在六倍體小麥中有3個拷貝。作為內(nèi)參基因，還要求其在不同的品種中拷貝數(shù)是穩(wěn)定的，并且內(nèi)參基因的擴增還要具有重復(fù)性。本研究借鑒Mayu等[32]的研究方法，用不同品種相同濃度的DNA驗證了內(nèi)參基因拷貝數(shù)的穩(wěn)定性，并用相同品種不同濃度的DNA驗證了內(nèi)參基因擴增的可重復(fù)性。因此，本研究設(shè)計的內(nèi)參系統(tǒng)（Acc1F/R和T-Acc1）可作為檢測六倍體小麥中目的基因拷貝數(shù)的內(nèi)參引物和探針。

目前，研究植物基因拷貝數(shù)的方法有很多，但利用ddPCR技術(shù)來檢測小麥目的基因拷貝數(shù)的報道很少。經(jīng)典的植物基因拷貝數(shù)檢測方法主要有Southern印跡雜交和qRT-PCR 2種[33-34]。其中傳統(tǒng)的Sounthern印跡雜交技術(shù)對DNA樣品的質(zhì)量和純度有一定的要求，其試驗周期長，雜交步驟繁瑣，并且對試驗技術(shù)條件要求較高；可能因存在等位基因，而導(dǎo)致檢測結(jié)果不能真實反映該基因的拷貝數(shù)；另外，試驗中所用的探針標記若采用同位素標記，對人體健康和環(huán)境安全存在嚴重威脅[35]。qRT-PCR檢測方法的步驟較為繁瑣，其需要準備標準DNA樣品，再利用標準DNA樣品繪制標準曲線，標準曲線的建立又需對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行不斷摸索與優(yōu)化，所需試驗周期較長[36]；借助標準曲線進行定量本身就是一種相對定量的方法，檢測結(jié)果可能不準確[37]。而ddPCR作為一種新興的、準確的絕對定量技術(shù)，與qRT-PCR相比，ddPCR的優(yōu)勢非常明顯，主要體現(xiàn)在以下幾個方面[38-39]：（1）靈敏度可達單個核酸分子，檢測限低至0.001%；（2）無需繪制標準曲線即可對DNA樣品進行絕對定量；（3）終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增曲線，特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測；（4）具有更好的準確度、精密度和重復(fù)性，可用于精確測定靶基因的拷貝數(shù)。本文以為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR和ddPCR 2種技術(shù)對8個樣品的位點LMW-GS基因進行拷貝數(shù)測定，結(jié)果基本一致，但ddPCR重復(fù)間的變異系數(shù)更小，且不依賴于標準曲線。在本研究中以為內(nèi)參基因，使用特異性引物和探針系統(tǒng)，采用ddPCR技術(shù)分別對231份普通小麥、和位點LMW-GS基因拷貝數(shù)進行測定，3個位點的基因拷貝數(shù)分別在3—9、4—9、4—9范圍內(nèi)，位點總拷貝數(shù)為10—21，這與前人通過Southen印跡雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)普通小麥的LMW-GS基因在總基因組中的拷貝數(shù)可能在10—15個和35—40個范圍內(nèi)基本相符[40-41]。

當拷貝數(shù)可變區(qū)域的劑量敏感基因或涉及調(diào)控作用的基因發(fā)生拷貝數(shù)變異時，也會對表型產(chǎn)生顯著的影響[42-43]。關(guān)于基因拷貝數(shù)變異對表型的影響在一些植物性狀上已有不少報道。小麥矮稈基因（）由于拷貝數(shù)的增加而導(dǎo)致植株高度降低，其致矮能力是單拷貝的3倍多[44]。在大麥中，硼轉(zhuǎn)運基因拷貝數(shù)的增加會使大麥Sahara具備硼毒性耐受性[45]。（C-重復(fù)結(jié)合因子）位于小麥和大麥的抗霜性位點2（），其拷貝數(shù)變異與低溫耐受性相關(guān)，冬小麥的拷貝數(shù)要高于春小麥，四倍體硬粒小麥和六倍體面包小麥的位點上大型基因的缺失（包括、和）會導(dǎo)致小麥耐寒性降低[46-49]。在小麥中隨著拷貝數(shù)的增加，會延長小麥春化時間導(dǎo)致開花推遲，而大麥中高拷貝數(shù)能夠加速開花時間[50-51]。以上研究表明，某些基因的拷貝數(shù)變異對相應(yīng)的表型有著重要的影響。

小麥低分子量麥谷蛋白（LMW-GS）賦予面筋強度和延展性，在小麥的營養(yǎng)品質(zhì)和面粉加工品質(zhì)形成中具有重要影響[2-3]，已有大量研究表明LMW-GS基因的組成和表達量與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)，不同種質(zhì)的小麥含有的LMW-GS等位基因不同，其編碼的LMW-GS亞基組合不同，因此對小麥面粉品質(zhì)產(chǎn)生的影響也不同[7-9]。而關(guān)于位點LMW-GS基因拷貝數(shù)變異對小麥面粉品質(zhì)的影響還未有報道。本研究將測定的231份普通小麥的、和位點LMW-GS基因拷貝數(shù)與小麥4個品質(zhì)性狀進行相關(guān)性分析，除位點基因拷貝數(shù)與2012年小麥面團穩(wěn)定時間和形成時間達到顯著負相關(guān)性外，其余均未達到顯著相關(guān)性，說明位點的LMW-GS拷貝數(shù)多樣性不是影響上述小麥品質(zhì)性狀的主要原因。

4 結(jié)論

以為內(nèi)參基因，構(gòu)建了內(nèi)參系統(tǒng)（引物和探針），它在品種間和同一品種不同濃度間均具有穩(wěn)定性和重復(fù)性，可用于小麥和其他目的基因拷貝數(shù)研究。qRT-PCR和ddPCR均可用于小麥中特定基因或位點的拷貝數(shù)檢測，但相較于前者，ddPCR方法變異系數(shù)更低，且具有操作簡單、結(jié)果更準確、檢測通量高等優(yōu)點。

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Analysis of copy number variation oflocus in Common wheat

CHEN Can, HAN Nannan, LIU Yang, SHI XiaoWei, SI HongQi, MA ChuanXi

College of Agronomy, Anhui Agriculture University/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Improvement on Southern Yellow & Huai River Valley, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hefei 230036

【】The variations in numbers of copies of a gene is a common and important gene structure variation, which often effects individual phenotype. Low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS) located at theloci, is an essential part of storage protein in wheat. As a hetero-hexaploid, the huge and complex wheat genome makes it difficult to detect numbers of gene copies by classical methods. A limited information is available about CNV analysis of LWM-GS. To screen reliable and stable internal reference genes and systems for complex genome and explore the CNV determination technology suitable in different wheat varieties, the techniques used for detection of gene copy numbers, based on droplet digital PCR (ddPCR) which improve the detection flux of target gene and determine the particular numbers of gene copies ofloci.【】In this paper,was used as the internal reference gene. The internal reference primers and probes were designed by using the corresponding gene sequence. In order to analyze stability of numbers of copies ofqRT-PCR was used to analyze the repeatability and accuracy ofinternal reference system (primers and probes).The corresponding specific primers and probes were designed according to the LMW-GS gene sequence ofloci. Two different methods, qRT-PCR and ddPCR, were used to detect the numbers of copies ofloci in eight wheat varieties, in order to determine which method is more suitable for high-throughput detection ofloci gene. The specific primers and probes were also designed according to the sequences of LMW-GS gene atandloci. The numbers of copies of LMW-GS gene at,andloci of 231 varieties were determined and analyzed by ddPCR.【】The results showed that the gene copy numbers of Acc1 was consistent among varieties and different DNA concentrations of the same variety. The coefficient of variation (CV) between repeats was 0.07%-0.77%. It is also indicated from results that theinternal reference system constructed in this paper has good stability and repeatability. The results of qRT-PCR and ddPCR were consistent in detecting the numbers of copies of LMW-GS gene atloci in 8 wheat varieties, which were 3, 5, 3, 4, 3, 3, 3 and 3, respectively. However, the CV among repeats detected by ddPCR was 0.30%-1.67%, which much lower than that by qRT-PCR. It showed that using ddPCR method to detect the gene copy numbers ofloci gene is more stable and reliable. The numbers of copies of LMW-GS gene were 4 at,andhaving a frequency of 95%, 32.03% 28.57% respectively in 231 wheat varieties. The total variation range in numbers of copies ofwas 10-21, and the CV was 16.12%.【】With good stability and repeatability,could be used as internal reference gene for numbers of gene copies detection in wheat. Both qRT-PCR and ddPCR could be used in gene copy numbers detection with wheat genes, but the ddPCR is more simple, stable, reliable and has high detection flux.

wheat; low-molecular-weight glutenin subunit (LMW-GS); droplet digital PCR (ddPCR); copy number variation (CNV)

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.002

2020-07-28；

2020-09-27

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0100804，2016YFD0101802）、國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-03）、安徽高校協(xié)同創(chuàng)新項目（GXXT-2019-033）、江蘇現(xiàn)代作物協(xié)同創(chuàng)新中心項目（JCIC-MCP）

陳璨，E-mail：chencan-L@163.com。韓南南，E-mail：1565635050@qq.com。陳璨和韓南南為同等貢獻作者。通信作者司紅起，E-mail：sihq2002@163.com。通信作者馬傳喜，E-mail：machuanxi@ahau.edu.cn

（責任編輯 李莉）