鄭海霞, 高玉林, 張方梅,3, 楊超霞,, 蔣健, 朱勛, 張?jiān)苹? 李祥瑞

馬鈴薯甲蟲熱激蛋白基因的克隆及溫度脅迫下的表達(dá)特性

鄭海霞1, 高玉林2, 張方梅2,3, 楊超霞1,2, 蔣健2, 朱勛2, 張?jiān)苹?, 李祥瑞2

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷 030801；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000

【】熱激蛋白（heat shock protein，HSP）是一種在生物體內(nèi)廣泛存在且高度保守的蛋白質(zhì)，在生物抗逆過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)生物體遭受不利環(huán)境條件脅迫時(shí)，其迅速產(chǎn)生可保證生物體的正常生理活動(dòng)。本研究以重大檢疫害蟲馬鈴薯甲蟲（）為研究對(duì)象，對(duì)其熱激蛋白HSP70基因（）進(jìn)行克隆，并對(duì)其在溫度脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行分析，明確HSP70在馬鈴薯甲蟲溫度脅迫中的作用?；贜CBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選馬鈴薯甲蟲HSP70的cDNA序列，利用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克??；利用DNAMAN軟件對(duì)其全長(zhǎng)序列進(jìn)行拼接；采用生物信息學(xué)方法對(duì)及其編碼氨基酸的序列特性進(jìn)行分析；使用MEGAX軟件的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建馬鈴薯甲蟲HSP70與其他昆蟲HSP70的系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)在不同溫度脅迫條件下的表達(dá)模式進(jìn)行分析；利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)所用的特異性引物?；贜CBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得3類馬鈴薯甲蟲HSP70 cDNA序列，分別命名為HSP70a、HSP70b和HSP70c，經(jīng)克隆、拼接獲得其全長(zhǎng)序列，分別命名為、和，GenBank登錄號(hào)分別為KC544268、KC544269和KC544270。序列分析表明，3個(gè)編碼的氨基酸序列均包含了完整保守結(jié)構(gòu)域和3段保守的HSP70家族簽名序列，且在氨基酸C末端具有保守的亞細(xì)胞定位基序。和的氨基酸C末端具有保守基序EEVD，屬于胞質(zhì)型熱激蛋白；的氨基酸C末端具有保守基序KDEL，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型熱激蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，和與其他物種的HSP70分別聚為一支，與已報(bào)道的馬鈴薯甲蟲HSP70聚為一支。其中，與龜紋瓢蟲（）的，與稻水象甲（）的，與大猿葉甲（）的同源性最高。qRT-PCR結(jié)果表明，高、低溫均能誘導(dǎo)馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲的3個(gè)的表達(dá)。不同溫度脅迫處理1 h后，馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲體內(nèi)3個(gè)的相對(duì)表達(dá)量未見顯著變化；而4 h后，馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比分別在低溫-10℃和高溫44℃時(shí)顯著上調(diào)至2.24和2.41倍，和相對(duì)表達(dá)量在脅迫4 h后與對(duì)照相比差異均不顯著。另外，無(wú)論是雌蟲還是雄蟲，3個(gè)的相對(duì)表達(dá)量在同一溫度不同的脅迫處理時(shí)間之間均無(wú)顯著差異?？梢皂憫?yīng)高、低溫脅迫，可能在馬鈴薯甲蟲抵御溫度脅迫中發(fā)揮作用，而和對(duì)高、低溫均不敏感，表明馬鈴薯甲蟲3個(gè)在抗溫度脅迫中發(fā)揮不同的作用。

馬鈴薯甲蟲；溫度脅迫；熱激蛋白70；表達(dá)譜

0 引言

【研究意義】馬鈴薯甲蟲（）是鞘翅目（Coleoptera）葉甲科（Chrysomelidae）的一種世界公認(rèn)的毀滅性害蟲，是我國(guó)重大檢疫對(duì)象之一。該蟲以成蟲、幼蟲危害馬鈴薯（）、茄子（）和番茄（）等多種茄科植物的莖葉、花蕾等部位[1-2]，同時(shí)傳播馬鈴薯褐斑病菌和環(huán)腐病菌等，造成馬鈴薯產(chǎn)量的重大損失[3-4]。馬鈴薯甲蟲成蟲不僅具有自主擴(kuò)散能力[5-6]，還對(duì)溫度[7]、殺蟲劑[1]等有著極強(qiáng)的抵抗力，成為了亞洲、歐洲、北美等地茄科植物的重要害蟲[1]。溫度是影響物種種群擴(kuò)散和分布的重要因素[8]，大量研究也證實(shí)馬鈴薯甲蟲具有很強(qiáng)的耐寒性和耐高溫能力，與其發(fā)育起點(diǎn)溫度、有效積溫、發(fā)育歷期、繁殖力及擴(kuò)散等都有著直接的關(guān)系[9-12]。因此，研究馬鈴薯甲蟲對(duì)溫度脅迫的響應(yīng)機(jī)制對(duì)其科學(xué)防控具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】熱激蛋白（heat shock protein，HSP）是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的抗逆蛋白，在進(jìn)化上高度保守。當(dāng)生物體遭受不利環(huán)境條件脅迫時(shí)，其迅速產(chǎn)生可保證生物體的正常生理活動(dòng)[13]。由于熱激蛋白分子量大小不同，一般將其分為4個(gè)家族，分別為HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP家族[14-15]。其中HSP70家族是最為保守的一類，存在于原核生物和真核生物體的所有細(xì)胞區(qū)室和器官中。一般情況下，HSP70以穩(wěn)定態(tài)存在于細(xì)胞漿內(nèi)，在應(yīng)激環(huán)境下，會(huì)迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，表達(dá)也迅速增加，僅有少量存在于細(xì)胞漿內(nèi)；當(dāng)應(yīng)激刺激消失，細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)，核內(nèi)的HSP70會(huì)迅速消失，而細(xì)胞漿內(nèi)仍有低水平的表達(dá)[16]。HSP70家族包括兩種蛋白質(zhì)：組成型熱激蛋白70（HSC70）和誘導(dǎo)型熱激蛋白70（HSP70），組成型熱激蛋白在正常環(huán)境下表達(dá)，不受外界因素的脅迫；而誘導(dǎo)型熱激蛋白在溫度等脅迫因子處理后，表達(dá)量急劇上升[17]。HSP70作為熱激蛋白家族中研究最廣泛、深入的一類，在生物體高、低溫脅迫中起著至關(guān)重要的作用[18-20]。國(guó)內(nèi)外對(duì)多種昆蟲的HSP70基因序列及其在溫度脅迫下的表達(dá)做了大量的研究。例如，高溫處理南美斑潛蠅（）[21]、梨小食心蟲（）[22]和空心蓮子草葉甲（）[23]等均可顯著提高HSP70基因的表達(dá)及昆蟲的耐熱性。不同齡期的赤擬谷盜（）在40℃高溫處理1 h后，HSP70基因表達(dá)比對(duì)照增加了1.1—2.0倍[24]。在低溫脅迫下，HSP70在昆蟲耐受性中同樣揮發(fā)作用。例如，黑腹果蠅（）在-7℃處理1 h后，HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上升[25]。褐飛虱（）在高溫脅迫下HSP70基因的表達(dá)量未發(fā)生改變，而低溫脅迫下其表達(dá)量明顯下降[26]。此外，HSP70不同亞族基因在相同溫度脅迫下表達(dá)模式也存在差異。比如三葉斑潛蠅（）的在高、低溫脅迫下表達(dá)量均能顯著增高，而和對(duì)溫度的脅迫不敏感，在受到溫度脅迫后其表達(dá)量無(wú)顯著變化[27]。褐飛虱HSP70家族的不同基因?qū)Ω?、低溫脅迫也表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式[28]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本團(tuán)隊(duì)前期已研究了馬鈴薯甲蟲HSP90和HSP60在高溫和低溫脅迫下的表達(dá)特點(diǎn)，表明二者可能在馬鈴薯甲蟲高溫脅迫下發(fā)揮作用[29-30]。但是不同的HSP基因在抵抗溫度脅迫時(shí)作用機(jī)制不同，有關(guān)馬鈴薯甲蟲HSP70基因（）的溫度脅迫作用還有待探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用生物信息學(xué)分析方法、RT-PCR及RACE技術(shù)，對(duì)的全長(zhǎng)基因進(jìn)行克隆、分析，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲在高、低溫脅迫條件下的表達(dá)情況，探討在溫度脅迫中的作用，為明確馬鈴薯甲蟲適應(yīng)溫度響應(yīng)的機(jī)制及其科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)昆蟲的采集分別于2012年6月和2018年6月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所安寧渠試驗(yàn)基地馬鈴薯試驗(yàn)田完成；試驗(yàn)昆蟲的處理及解剖于2018年6月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成；基因克隆試驗(yàn)于2012年、其余所有試驗(yàn)于2018—2019年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 試驗(yàn)昆蟲

馬鈴薯甲蟲試驗(yàn)種群采自于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所安寧渠試驗(yàn)基地馬鈴薯試驗(yàn)田（87°28′28￠￠E，43°57′7￠￠N）。采回當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室后，在室溫（25℃）條件下，置于圓柱形養(yǎng)蟲盒內(nèi)（直徑12 cm，高12 cm）飼養(yǎng)，養(yǎng)蟲盒內(nèi)放入新鮮的馬鈴薯葉片，利用紗布網(wǎng)封口保證透氣。溫度處理時(shí)，將馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲分別取出，放入鋪有馬鈴薯葉片的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，每皿10只，置于不同設(shè)置溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，設(shè)定溫度分別為-10、0、38和44℃，處理時(shí)間為1和4 h，每個(gè)處理重復(fù)3次，以室溫（25℃）作為對(duì)照。處理完成后，將馬鈴薯甲蟲迅速取出，用解剖刀切成厚度不超過0.5 cm的組織塊，放入含有RNAlater的1.5 mL離心管中，于4℃冰箱中過夜，保證RNAlater全部浸透組織，最后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

主要試劑：TRIzol試劑盒和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；3￠Full RACE Core Set Ver. 2.0試劑盒、dNTP、Taq酶和SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)于大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于德國(guó)OMEGA公司；克隆載體pEASY-T1、感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1和DNA marker購(gòu)于法國(guó)Transgene公司。引物合成與測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

主要儀器：ND-2000微量分光光度儀（美國(guó)Thermo Scienfic公司）；PCR儀536-TouchGene?Gradient（英國(guó)EDVOTEK公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500 Fast（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 馬鈴薯甲蟲總RNA的提取及一鏈cDNA的合成 用Trizol法抽提馬鈴薯甲蟲的總RNA，用微量分光光度儀檢測(cè)總RNA的濃度，2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)其質(zhì)量。最后，根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明書合成cDNA第一鏈。

1.3.2 馬鈴薯甲蟲HSP70基因片段的篩選及克隆 在NCBI庫(kù)中檢索篩選馬鈴薯甲蟲HSP70的cDNA序列，共檢索到3類，分別命名為HSP70a、HSP70b和HSP70c。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列及對(duì)應(yīng)的PCR退火溫度見表1。通過多輪PCR擴(kuò)增獲得馬鈴薯甲蟲HSP70的序列片段。具體PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min。利用膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化，再連接到pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，最后進(jìn)行菌落PCR陽(yáng)性克隆鑒定，送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性。

表1 試驗(yàn)所用引物

1.3.3 馬鈴薯甲蟲HSP70的全長(zhǎng)序列擴(kuò)增 根據(jù)1.3.2驗(yàn)證的馬鈴薯甲蟲HSP70的cDNA片段，設(shè)計(jì)3個(gè)的特異性引物（表1），進(jìn)行3′ RACE擴(kuò)增獲得HSP70的全長(zhǎng)序列，具體按照試劑盒說(shuō)明書中的操作完成。

1.3.4在溫度脅迫下的表達(dá) 提取不同溫度處理下的馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲的總RNA，取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋10倍作為模板，用于qRT-PCR反應(yīng)。以室溫（25℃）作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，每次取3頭整蟲提取總RNA混樣，每個(gè)樣品重復(fù)3次。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶GADPH（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase）和-微管蛋白TUB（alpha-tubulin）基因作為內(nèi)參基因[28]，用于qRT-PCR的引物和內(nèi)參特異性引物見表1。具體qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性3 s，60℃退火與延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；最后在60℃收集熒光信號(hào)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 序列和數(shù)據(jù)分析

利用DNAMAN軟件對(duì)馬鈴薯甲蟲HSP70的全長(zhǎng)序列進(jìn)行拼接，然后輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析。利用Biology WorkBench（http://workbench.sdsc. edu/）在線工具獲得基因完整的開放閱讀框；利用Compute pI/Mw tool（http://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量。利用ClustalW軟件對(duì)馬鈴薯甲蟲與其他昆蟲HSP70基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用MEGAX軟件構(gòu)建neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹（bootrap重復(fù)1 000次），最后采用FigTree軟件（v1.4.3）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行標(biāo)記。利用SWISS- MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)合PyMOL軟件對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行編輯與輸出。

利用SAS9.2（SAS Insitute Inc.，Cary，NC，美國(guó)）軟件，采用單因素方差（One-way，ANOVA，LSD分析法）分析相對(duì)表達(dá)量在不同溫度脅迫下的差異顯著性；并采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)（-test）分析相對(duì)表達(dá)量在某一脅迫溫度下不同處理時(shí)間之間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Ld-hsp70的克隆

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索比對(duì)，獲取3個(gè)馬鈴薯甲蟲的HSP70a片段，分別設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)hsp70aF1和hsp70aR1，hsp70aF2和hsp70aR2，hsp70aF3和hsp70aR3，得到了長(zhǎng)度分別為316、297和322 bp的3個(gè)片段。進(jìn)而設(shè)計(jì)特異性引物hsp70aF4和hsp70aR4，以合成的cDNA為模板，進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度為807 bp的片段。以hsp70aF2和hsp70aR3配對(duì)，進(jìn)行第3輪PCR擴(kuò)增，獲得了一段長(zhǎng)1 071 bp的片段，確定為HSP70a的5￠端全長(zhǎng)序列（圖1-A）。接著，以3￠RACE的cDNA為模板，以hsp70aF3和3￠RACE Inner Primer配對(duì)，進(jìn)行3￠RACE擴(kuò)增，獲得一段長(zhǎng)為611 bp的3￠端全長(zhǎng)序列（圖1-B）。最后設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增，得到編碼ORF區(qū)域的全長(zhǎng)序列為1 947 bp（圖1-C）。該全長(zhǎng)序列的5′ UTR長(zhǎng)92 bp，3′ UTR長(zhǎng)160 bp，將其命名為，提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KC544268。馬鈴薯甲蟲HSP70b全長(zhǎng)cDNA序列的克隆過程同上（圖1-D—F）。最后獲得長(zhǎng)度為2 397 bp的HSP70b全長(zhǎng)cDNA序列，其ORF長(zhǎng)1 974 bp，5′ UTR長(zhǎng)132 bp，3′ UTR長(zhǎng)291 bp，將其命名為，NCBI登錄號(hào)為KC544269。馬鈴薯甲蟲HSP70c全長(zhǎng)cDNA序列的克隆過程同上（圖1-G—I）。最后經(jīng)DNAMAN軟件拼接后得到了長(zhǎng)度為2 482 bp的全長(zhǎng)cDNA序列，其ORF長(zhǎng)1 890 bp，5′ UTR長(zhǎng)289 bp，3′ UTR長(zhǎng)303 bp，將其命名為，NCBI登錄號(hào)為KC544270。

2.2 Ld-hsp70序列分析

、和的開放閱讀框分別編碼648、657和629個(gè)氨基酸，3′端非翻譯區(qū)含有PolyA尾及多聚腺苷酸信號(hào)序列AATAAA。預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子量分別為71.07、72.86和68.72 kD，等電點(diǎn)分別為5.33、5.06和5.58。3個(gè)HSP70序列中均具有HSP70家族3段完整的簽名序列，分別為GIDLGTTYSCV、FDLGGGTFDVS、VLVGGSTRIPK，說(shuō)明此3種蛋白屬于HSP70家族和的氨基酸C末端序列為EEVD，表明該蛋白質(zhì)具有胞質(zhì)型熱激蛋白氨基酸特征；的氨基酸C末端序列為KDEL，表明該蛋白質(zhì)具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型熱激蛋白氨基酸特征，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型熱激蛋白。此外，的C末端具有兩個(gè)GGXP四肽序列，而和C末端均無(wú)該序列（圖2）。

序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，、和三者之間的氨基酸序列相似性為71.50%。與的氨基酸序列相似性為71.85%，而與與的序列相似性分別為59.26%和56.50%。將3個(gè)HSP70的氨基酸序列與已報(bào)道的兩個(gè)馬鈴薯甲蟲的HSP70（GenBank登錄號(hào)分別為AF288978和AF322911）氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，其序列相似性為70.94%（圖2）。

利用SWISS-MODEL工具建模，以家牛（）的HSC70為模板（PDB登錄號(hào)：3c7n），預(yù)測(cè)和編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖3-A、3-C），以家牛的HSC70為模板（PDB登錄號(hào)：1yuw），預(yù)測(cè)編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖3-B）。結(jié)果表明，馬鈴薯甲蟲3個(gè)HSP70的三維結(jié)構(gòu)與已知其他物種的HSP70相似度很高，3個(gè)HSP70蛋白N端44 kD的片段內(nèi)含有4個(gè)域形成兩瓣，兩瓣中間形成一個(gè)深槽，該區(qū)域包含高度保守的ATPase功能域（ATP binding domain）；靠近C端18 kD保守的肽結(jié)合域（peptide binding domain），由兩個(gè)四聯(lián)反向平行的-折疊和一個(gè)-螺旋組成。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

選取來(lái)自于膜翅目、雙翅目、鱗翅目、鞘翅目等昆蟲的38個(gè)HSP70基因和馬鈴薯甲蟲的5個(gè)HSP70基因構(gòu)建系統(tǒng)系發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，馬鈴薯甲蟲5個(gè)HSP70分別聚類到三大支，和與其他物種的HSP70分別獨(dú)聚為一支，與已報(bào)道的馬鈴薯甲蟲兩個(gè)HSP70聚為一支，進(jìn)化距離較近，與和的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

與其他物種比較，與龜紋瓢蟲（）的聚為一支，同源性最高，與稻水象甲（）的同源性最高，與大猿葉甲（）的同源性最高。膜翅目、雙翅目、鱗翅目、鞘翅目也都能各自聚類。該聚類結(jié)果能將昆蟲歸類到各自傳統(tǒng)的分類地位中，說(shuō)明HSP70可以作為系統(tǒng)進(jìn)化分析的參照基因。

A：Ld-HSP70a篩選片段的PCR產(chǎn)物PCR product of Ld-HSP70a fragment；B：3′ RACE產(chǎn)物PCR product of 3′ RACE；C：全長(zhǎng)ORF的PCR產(chǎn)物PCR product of full-length ORF；D：Ld-HSP70b篩選片段的PCR產(chǎn)物PCR product of Ld-HSP70b fragment；E：3′ RACE產(chǎn)物PCR product of 3′ RACE；F：全長(zhǎng)ORF的PCR產(chǎn)物PCR product of full-length ORF；G：Ld-HSP70c篩選片段的PCR產(chǎn)物PCR product of Ld-HSP70c fragment；H：3′ RACE產(chǎn)物PCR product of 3′ RACE；I：全長(zhǎng)ORF的PCR產(chǎn)物PCR product of full-length ORF；M1：100 bp ladder DNA maker；M2：BM2000 DNA maker；1—9（箭頭Arrow）： PCR 產(chǎn)物 PCR products

HSP70蛋白來(lái)源及GenBank登錄號(hào) Origin of HSP70 protein and their GenBank accession numbers：馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineataLd-hsp70a（KC544268）；Ld-hsp70b（KC544269）；Ld-hsp70c（KC544270）；LdHSP70A（AF288978）；LdHSP70B（AF322911）。下劃線：3段保守的HSP70家族簽名序列Underlined: three conserved motifs of the HSP70 family；方框：胞質(zhì)型標(biāo)志性基序（EEVD）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型HSPC末端標(biāo)志性基序（KDEL）Box: the cytoplasmic HSP70 carboxyl terminal region (EEVD) and the endoplasmic reticulum HSP70 carboxyl terminal region (KDEL)；箭頭：C末端具有兩個(gè)GGXP四肽序列Arrows: two GGXP quaternary peptide sequences at the c-terminal；黑色區(qū)域：高度保守的氨基酸Black blocks: highly conserved amino acids

A: Ld-hsp70a; B: Ld-hsp70b; C: Ld-hsp70c

藍(lán)色blue：鞘翅目Coleoptera；綠色green：鱗翅目Lepidoptera；黃色Yellow：雙翅目Diptera；紅色red：膜翅目Hymenoptera。星號(hào)*標(biāo)注為本文中的3個(gè)HSP70 Asterisks* are three HSP70s in this study。HSP70s選取的物種來(lái)源及其在GenBank中的登錄號(hào)Origin species of HSP70s and their accession numbers in GenBank：鱗翅目Lepidoptera：天蠶Antheraea yamamai（BAD18974），家蠶Bombyx mori（BAF69068），細(xì)紋夜蛾Spodoptera litura（ADV03160），粉莖螟Sesamia nonagrioides（ABZ10939），玉米夜蛾Helicoverpa zea（ACV32640），小菜蛾P(guān)lutella xylostella（ADK94697），蒲氏鉤蝠蛾Thitarodes pui（ADA61012），二化螟Chilo suppressalis（ADE05296），玉米螟Ostrinia furnacalis（ADR00357），落葉松毛蟲Dendrolimus superans（ABM90551），黎豆夜蛾Anticarsia gemmatalis（ADO32621），球菜夜蛾Agrotis ipsilon（AEG78288），甘藍(lán)夜蛾Mamestra brassicae（BAF03556），印度谷螟Plodia interpunctella（ABM88156），粉紋夜蛾Trichoplusia ni（ABH09735），草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（AAN86047）；鞘翅目Coleoptera：空心蓮子草葉甲Agasicles hygrophila（KF792067），黃粉蟲Tenebrio molitor（JQ219848，JQ219849），謝氏寬漠王Mantichorula semenowi（GU289400），光滑鱉甲Anatolica polita borealis（EF569673），稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus（KC620437，KC620428），龜紋瓢蟲Propylea japonica（KJ483960），大猿葉甲Colaphellus bowringi（KF214746），赤擬谷盜Tribolium castaneum（MK000439），中華豆芫菁Epicauta chinensis（KR181952），準(zhǔn)噶爾小胸鱉甲Microdera dzhungaricapunctipennis（JF421286），三開蜣螂Copris tripartitus（EF208962），松墨天牛Monochamus alternatus（AF288978），馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata（AF288978，AF322911，KC544268，KC544269，KC544270）；雙翅目Diptera：埃及伊蚊Aedes aegypti（ACJ64193），尖音庫(kù)蚊Culex pipiens（AAX84696），果蠅Drosophila melanogaster（AAG26887），蘋果實(shí)蠅Rhagoletis pomonella（ABL06948），南美斑潛蠅Liriomyza huidobrensis（AAW32098）；膜翅目Hymenoptera：金小蜂Nasonia vitripennis（XP_001606463），佛羅里達(dá)弓背蟻Camponotus floridanus（EFN61604），葉切蟻Acromyrmex echinatior（EGI70210）

2.4 溫度脅迫下Ld-hsp70的表達(dá)

不同的溫度和時(shí)間處理均能誘導(dǎo)馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲一定程度的表達(dá)。不同溫度脅迫1 h后，馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲體內(nèi)3個(gè)的相對(duì)表達(dá)量雖有一定程度的升高或降低，但與對(duì)照組（25℃）相比均無(wú)顯著差異；不同溫度脅迫處理4 h后，雌、雄成蟲的相對(duì)表達(dá)量均有提高，其的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比分別在低溫-10℃和高溫44℃時(shí)顯著上調(diào)至2.24和2.41倍（圖5-A、5-B）。

和在高低溫脅迫處理4 h后，相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異（圖5-C—F）；另外，無(wú)論是雌蟲還是雄蟲，3個(gè)的相對(duì)表達(dá)量在同一溫度不同的脅迫處理時(shí)間下均無(wú)顯著差異。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同大、小寫字母分別表示處理1 h和4 h時(shí)不同溫度處理間差異顯著（P＜0.05）（LSD法）Data in the figure are mean±SEand different letters above the bars indicate significant difference among different treatment temperatures for 1 h and 4 h, respectively (P＜0.05) (LSD method)

3 討論

3.1 Ld-hsp70序列分析

本研究成功克隆了3個(gè)馬鈴薯甲蟲的全長(zhǎng)序列，并且它們編碼的氨基酸序列均包含了完整保守結(jié)構(gòu)域和3段保守的HSP70家族的典型基序，表明這3個(gè)屬于典型的HSP家族。這些基因在氨基酸C末端均具有保守的亞細(xì)胞定位基序，的C末端具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保守基序KDEL，和的C末端具有細(xì)胞質(zhì)保守基序EEVD，表明Ld-hsp70b蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而Ld-hsp70a和Ld-hsp70c蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)中[31-32]，這種相似的保守基序也存在于HSP90家族中（細(xì)胞質(zhì)定位基序MEEVD；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位基序KDEL或HDEL）[33]。馬鈴薯甲蟲HSP70家族的3個(gè)成員位于不同的細(xì)胞器中，在其他昆蟲中也有相同的發(fā)現(xiàn)，如珍珠邊豹紋蝶（）有7個(gè)HSP70基因，1個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，6個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)[34]；褐飛虱HSP70的15個(gè)家族成員，2個(gè)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，3個(gè)位于線粒體，其余位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核[28]。

序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與的氨基酸序列相似性為71.85%，而與、的序列相似性分別只有59.26%和56.50%，表明在相同物種中，同一細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的HSP70之間相似度更高。根據(jù)HSP70在靠近C端是否具有簡(jiǎn)并重復(fù)的四肽序列GGXP，可將HSP70分為誘導(dǎo)型和組成型[35-36]。本研究中的編碼蛋白有兩個(gè)短肽GGXP序列出現(xiàn)在C端，可以推斷屬于誘導(dǎo)型HSP70，該類型只有受到外界因素誘導(dǎo)后才會(huì)大量增加，且這些重復(fù)序列可提供帶負(fù)電且柔和的疏水性界面，促進(jìn)蛋白合成中間體的排列折疊[37]；而其他兩個(gè)在C端無(wú)GGXP序列，屬于組成型HSP70，一般在無(wú)外界誘導(dǎo)時(shí)便有一定量的表達(dá)[38]。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，3個(gè)分別聚類到3個(gè)分支上，表明其可能在馬鈴薯甲蟲抵御不良的環(huán)境脅迫中發(fā)揮的作用不同。研究表明，HSP70基因可以作為系統(tǒng)進(jìn)化研究的標(biāo)志基因[39]。在馬鈴薯甲蟲的HSP70系統(tǒng)進(jìn)化樹中，不同昆蟲HSP70按照不同目單獨(dú)聚類，親緣關(guān)系較近的昆蟲在系統(tǒng)進(jìn)化樹上HSP70位置較近，該結(jié)果與煙蚜（）[40]、三葉斑潛蠅[27]等昆蟲的HSP70聚類結(jié)果一致。這一研究結(jié)果也與馬鈴薯甲蟲HSP90進(jìn)化分析結(jié)果一致，均可作為生物系統(tǒng)進(jìn)化分析的候選基因[29]。

馬鈴薯甲蟲HSP70蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析表明，3個(gè)HSP70蛋白N端均包含ATPase功能域，對(duì)ATP具有極高的親和能力，ATPase功能域參與熱激蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)換、形成HSP70的分子伴侶復(fù)合物，并且在底物蛋白折疊的過程中至關(guān)重要[18,41]。馬鈴薯甲蟲HSP70蛋白的C端是多肽結(jié)合區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)其可以通過蛋白結(jié)構(gòu)上的一段鉸鏈區(qū)連接到N端核酸部位，引導(dǎo)多肽的折疊，起到分子伴侶作用[42]。與馬鈴薯甲蟲熱激蛋白60、90相比，這3類蛋白在結(jié)構(gòu)上存在較大差異，如HSP90具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：LM結(jié)構(gòu)域（large middle domain）、SM結(jié)構(gòu)域（small middle domain）和C結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain），LM結(jié)構(gòu)域包含與分子伴侶、ATP和有害化學(xué)物質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)，SM結(jié)構(gòu)域主要參與分子伴侶和下游蛋白結(jié)合，C結(jié)構(gòu)域參與二聚化，且含有與有害化學(xué)物質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)[29]；HSP60也具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：頂端域、赤道域和中間域，頂端域是底物結(jié)合部位，赤道域是ATP結(jié)合部位，中間域連接頂端域和赤道域[30]。這些高度保守的三維結(jié)構(gòu)與其功能密不可分，表明馬鈴薯甲蟲的這3類熱激蛋白在其應(yīng)激刺激中可能發(fā)揮不同的作用。

3.2 Ld-hsp70在溫度脅迫下的功能分析

HSP70是與生物體溫度耐受性關(guān)系最為密切的一類蛋白質(zhì)，許多報(bào)道已證實(shí)高溫和低溫均能誘導(dǎo)生物體內(nèi)的表達(dá)[22-23,26-27,43]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲的3個(gè)在不同溫度和時(shí)間脅迫下均能誘導(dǎo)表達(dá)，但是3個(gè)具有不同的誘導(dǎo)表達(dá)特異性，這一結(jié)果與三葉斑潛蠅的3個(gè)表達(dá)結(jié)果相似[26]。在馬鈴薯甲蟲雌、雄成蟲中的最佳誘導(dǎo)溫度不同。在雌蟲中，低溫-10℃脅迫處理4 h后，的相對(duì)表達(dá)量升至對(duì)照的2.24倍，表明在低溫脅迫后馬鈴薯甲蟲通過提高體內(nèi)的表達(dá)量，來(lái)幫助新生肽鏈的正確折疊，提高馬鈴薯甲蟲對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)力。而雄蟲在高溫44℃脅迫處理4 h后相對(duì)表達(dá)量顯著上升，說(shuō)明雌、雄兩性成蟲可能對(duì)溫度的敏感性存在差異。此種現(xiàn)象在其他昆蟲中也有類似發(fā)現(xiàn)，如Chen等[22]發(fā)現(xiàn)梨小食心蟲在極端溫度脅迫下雌蟲HSP70基因的表達(dá)相比雄蟲更敏感。楊苑釗[44]發(fā)現(xiàn)西藏飛蝗（）雄蟲應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)HSP70基因誘導(dǎo)表達(dá)更為敏感。的相對(duì)表達(dá)量隨著溫度升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明該基因?qū)儆谡T導(dǎo)型蛋白，序列分析結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，筆者推測(cè)在馬鈴薯甲蟲熱耐受性過程中具有重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)和在不同溫度和不同時(shí)間脅迫下相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，推測(cè)這兩個(gè)的作用并不能提高馬鈴薯甲蟲的溫度脅迫耐受性，而是受溫度以外的其他因子調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP70蛋白在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的合成有一定的閾值，一旦超過這個(gè)閾值，HSP70蛋白的合成將出現(xiàn)下降[45-46]。因此，和的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，也可能是長(zhǎng)時(shí)間溫度脅迫損傷了馬鈴薯甲蟲的部分機(jī)體，造成的損傷超出了對(duì)機(jī)體的保護(hù)能力，從而導(dǎo)致馬鈴薯甲蟲熱激蛋白表達(dá)途徑的關(guān)閉。在三葉斑潛蠅[45]、美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅[21]、褐飛虱[46]等昆蟲中均有類似的報(bào)道。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)馬鈴薯甲蟲成蟲體內(nèi)的3個(gè)相對(duì)表達(dá)量在同一溫度、不同脅迫處理時(shí)間下均無(wú)顯著差異，表明在本試驗(yàn)設(shè)定的同一溫度下的相對(duì)表達(dá)量與處理時(shí)間之前沒有顯現(xiàn)出相關(guān)性。

同一物種不同組織間HSP70的同源性低于不同物種相同組織[28]。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的HSP70與一般HSP70的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳距離大于不同物種間相同組織來(lái)源的HSP70。且位于不同組織的HSP70在減少昆蟲所受脅迫傷害中具有一定的協(xié)同作用，如位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)的HSP70可通過協(xié)同作用提高昆蟲機(jī)體對(duì)高溫的適應(yīng)性[47]。本研究對(duì)3個(gè)的氨基酸序列分析表明，Ld-hsp70b屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型熱激蛋白，Ld-hsp70a和Ld-hsp70c屬于胞質(zhì)型熱激蛋白，表達(dá)量變化相對(duì)顯著，而和卻與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，3個(gè)的表達(dá)情況也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。在應(yīng)對(duì)溫度脅迫時(shí)，馬鈴薯甲蟲體內(nèi)并非某一熱激蛋白起作用，而是由不同熱激蛋白共同協(xié)作抵抗逆境脅迫。而馬鈴薯甲蟲體內(nèi)這些不同是如何協(xié)作來(lái)抵御環(huán)境脅迫還需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

馬鈴薯甲蟲在雌蟲遭受低溫脅迫時(shí)顯著升高，在雄蟲遭受高溫脅迫時(shí)顯著升高，其對(duì)高、低溫均敏感，可能在馬鈴薯甲蟲抵御極端溫度脅迫中發(fā)揮作用。而和對(duì)高、低溫均不敏感。推測(cè)馬鈴薯甲蟲同一家族的3個(gè)在相同刺激下可能具有不同功能。

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Cloning of Heat Shock Protein Geneand its Expression Characteristics under Temperature Stress

ZHENG HaiXia1, GAO YuLin2, ZHANG FangMei2,3, YANG ChaoXia1,2, JIANG Jian2, ZHU Xun2, ZHANG YunHui2, LI XiangRui2

1College of Plant Protection, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;3College of Agronomy, Xinyang Agriculture and Forestry University, Xinyang 464000, Henan

【】Heat shock protein (HSP), a class of highly conserved proteins, is generally found in all the organisms, which plays an important role in response to stress resistance. In order to ensure the normal physiological activities of the organism, the expression of HSP can be generated rapidly under the adverse environmental conditions. The objective of this study is to clone heat shock protein 70 (HSP70) genes of the important quarantine pest(), analyze their expression characteristics under temperature stress, and to clarify the function ofHSP70 under temperature stress.【】The cDNA sequences of HSP70 genes ofwere obtained based on the NCBI database. The full length cDNAs encoding HSP70 genes ofwere cloned by RT-PCR and RACE technology. The full-length sequences were spliced by DNAMAN software. The sequence characteristics ofwere analyzed by bioinformatic methods. The phylogenetic tree with the homologous sequences of HSP70 fromand other insects was constructed using the neighbor-joining (NJ) method with MEGAX software. The expression profiles ofwere analyzed by qRT-PCR.the specific primers were designed using Primer 5.0 software.【】The cDNA sequences of three HSP70 genes ofwere obtained from the NCBI database, and were named as HSP70a, HSP70b and HSP70c, respectively. Three full-length sequences were obtained by cloning and splicing, and were named as,and, respectively. The GenBank accession numbers were KC544268, KC544269 and KC544270, respectively. Sequence analysis showed that complete conserved domain, three signature sequences of HSP70 family, signal sequences and motifs of subcellular location at the carboxyl (C)-terminal were found in amino acid sequences of the three. The conserved EEVD motif in the C-terminal ofandindicated that they were cytosolic HSP70. The conserved KDEL motif in the C-terminal ofindicated that it was endoplasmic reticulum HSP70. Phylogenetic tree analysis showedandwere clustered together with HSP70 from other insect species, whilewas clustered together with the reported HSP70 from.,andhad highest homology with,, and, respectively. qRT-PCR results showed that the expression of all threecould be induced by high and low temperatures. No significant difference was observed in the relative expression of the threes after exposure to different temperatures for 1 h. the relative expression level ofwas significantly upregulated by 2.24 and 2.41 folds after exposure to -10℃ and 44℃ for 4 h in female and male of, respectively. However, no significant difference was observed in the relative expression ofandunder temperature treatments for 4 h. Whetherin female or male, no significant difference was observed of different treatment times at the same temperature.【】incan respond to temperature stress and may play an important role in the adaptation to adverse temperatures.andare not very sensitive to temperature stress, suggesting functional differentiation of the threein response to abiotic stress.

; temperature stress; heat shock protein 70; expression profile

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.008

2020-05-28；

2020-06-29

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD02008）、山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（201801D221305）、山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（201803D22104-8）

鄭海霞，E-mail：zhenghaixia722@163.com。通信作者李祥瑞，E-mail：xrli@ippcaas.cn。通信作者張?jiān)苹郏珽-mail：yhzhang@ippcaas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）