徐翔，解屹，宋麗云，申莉莉，李瑩，王勇，劉明宏，劉東陽，王小彥，趙存孝，王鳳龍，楊金廣

高效靶向降解煙草花葉病毒核酸的dsRNA篩選與大量制備

徐翔1，解屹1，宋麗云1，申莉莉1，李瑩1，王勇2，劉明宏3，劉東陽2，王小彥3，趙存孝4，王鳳龍1，楊金廣1

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101；2四川省煙草公司涼山州公司，四川西昌 615000；3貴州省煙草公司遵義市公司，貴州遵義 563000；4甘肅省煙草公司慶陽市公司，甘肅慶陽 745099

【】篩選高效靶向降解煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的dsRNA，實現(xiàn)其大量制備，并探究其作用機(jī)制。以TMV編碼的CP、MP、RdRP功能基因為靶序列，體外轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的dsRNA，浸潤本氏煙（），24 h后接種TMV，于接毒后2、3 d取樣提取總RNA和蛋白質(zhì)，以CP基因mRNA水平和蛋白水平為指標(biāo)，結(jié)合TMV病毒生物學(xué)癥狀，綜合評價各dsRNA對TMV的抑制效果。同時結(jié)合侵染性克隆TMV-30B在本氏煙煙株上的熒光表達(dá)現(xiàn)象和TMV在三生煙（var. Samsun NN）上的過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive necrosis reaction），通過比較TMV基因組上6個靶序列相對應(yīng)的dsRNA，篩選出高效抑制TMV的dsRNA片段。為了獲取大量的dsRNA，將dsRNA對應(yīng)的基因片段插入到原核表達(dá)載體L4440的雙T7啟動子之間，轉(zhuǎn)化至RNase III缺陷型大腸桿菌（）HT115（DE3）中，并對原核表達(dá)制備的dsRNA噴施煙草后生成的siRNA進(jìn)行深度測序，比較外源施用dsRNA后，對TMV侵染的small RNA表達(dá)特征和富集帶的影響。篩選出高效影響TMV CP基因表達(dá)的dsRNA RdRP1461-1774，并構(gòu)建了可誘導(dǎo)形成目的dsRNA的原核表達(dá)載體L4440-dsRdRP1461-1774，可在DE3中大量制備RdRP1461-1774的dsRNA，菌液中提取的dsRNA噴施于煙草上對TMV的防治效果顯著。TMV-30B侵染本氏煙時熒光數(shù)量減少，并能夠延長葉片萎蔫時間，在三生煙上施用時葉片枯斑數(shù)量明顯減少。小RNA測序結(jié)果顯示TMV侵染引起的RNAi過程中正義鏈和反義鏈以大致相等的頻率產(chǎn)生siRNA，而外源性dsRNA的浸潤會引起靶向區(qū)域siRNA的富集，siRNA反義鏈累積量驟增，對應(yīng)的正義鏈累積量驟減，外源dsRNA的施用能夠引起siRNA表達(dá)豐度的變化。通過比較dsRNA介導(dǎo)植物靶向抗TMV侵染的效果來篩選抗煙草花葉病毒的dsRNA序列，最終選定TMV RdRP基因上一段長313 bp的高效作用片段，該片段dsRNA能夠高效與靶基因結(jié)合，降低染病植株煙草花葉病毒的表達(dá)量。同時構(gòu)建了RdRP1461-1774基因的dsRNA原核表達(dá)系統(tǒng)，實現(xiàn)其低成本的高效量產(chǎn)，為后續(xù)dsRNA在植物病毒方面的防治應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

煙草花葉病毒；RNA干擾；dsRNA；small RNA測序；原核表達(dá)

0 引言

【研究意義】煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）屬正單鏈RNA病毒，具有廣泛的寄主范圍，可侵染茄科、十字花科、葫蘆科和菊科等多種主要的經(jīng)濟(jì)作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[1]。在煙草上，由TMV侵染引起的煙草病毒病可造成煙葉產(chǎn)量損失達(dá)30%—50%，個別地塊甚至絕產(chǎn)，危害十分嚴(yán)重。除種植抗病品種外，生產(chǎn)上尚無有效的防治措施進(jìn)行控制。通過篩選靶向抗TMV的雙鏈RNA （double- stranded RNA，dsRNA）并實現(xiàn)其大量制備，可為后續(xù)研究dsRNA誘導(dǎo)RNA干擾（RNA interference，RNAi）防治植物病毒病提供物質(zhì)基礎(chǔ)，同時應(yīng)用小RNA測序比較短鏈siRNA（small interference RNA，siRNA）富集區(qū)的變化特征，可為利用該策略篩選特異性片段防治植物病毒病的研究提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】RNAi屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post- transcriptional gene silencing，PTGS），是由dsRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因沉默現(xiàn)象，dsRNA被RNase Ⅲ家族的Dicer蛋白切割成siRNA，不同來源的dsRNA被Dicer酶切割后，通過與不同的AGO蛋白結(jié)合而行使功能[2]。siRNA解鏈后與AGO蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），降解序列互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA，在RNA水平上調(diào)控基因的表達(dá)[3]。siRNA是sRNA（small RNA，sRNA）的主要組成部分，sRNA廣泛存在于植物中，并且種類多樣，多是利用不同的RNA雙鏈為前體切割而成的一類siRNA[4]。RNA沉默過程中還存在級聯(lián)放大效應(yīng)，即以siRNA中的一條鏈為引物，以mRNA為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的作用下合成新的次級siRNA，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的循環(huán)擴(kuò)大反應(yīng)[5]。自然界中植物本身能夠表達(dá)病毒的部分基因組來免疫病毒或類病毒，鑒于此，用轉(zhuǎn)基因的方式實現(xiàn)了內(nèi)源基因的沉默。Hameed等將3種馬鈴薯病毒——馬鈴薯X病毒（potato virus X，PVX）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、馬鈴薯S病毒（potato virus S，PVS）基因序列設(shè)計成600 bp反向重復(fù)序列載體，將其轉(zhuǎn)入到馬鈴薯細(xì)胞中，該載體可以表達(dá)出具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，獲得對這3種病毒均有抗性的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系[6]。但是轉(zhuǎn)基因體系可能存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)[7]，因此難以獲得具有強(qiáng)抗性的轉(zhuǎn)基因品系。與轉(zhuǎn)基因的方法相比，利用原核系統(tǒng)表達(dá)dsRNA來干擾病毒的侵染，減輕病毒病的危害，這一方法避開了轉(zhuǎn)基因工作量大、周期長、費(fèi)時費(fèi)力的弊端，并且可以針對多種病毒，同時混合多種病原的dsRNA，與轉(zhuǎn)基因植物相比優(yōu)勢明顯，更加利于推廣。常見的植物病毒病多是由RNA病毒引起的，因此植物體內(nèi)的RNAi機(jī)制本身就是一道天然抗病屏障，如何將該原理用于生產(chǎn)從而實現(xiàn)對病毒病的防治是近些年的研究熱點(diǎn)[8]。2003年，Tenllado等[9]利用體外噴施dsRNA的方法防治植物病毒病，開啟了RNAi農(nóng)藥的研究熱潮。該研究采用大腸桿菌（）特異性菌株初步建立了dsRNA的細(xì)菌大量生產(chǎn)體系和粗提方法，針對辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）的PMMoV IR 54基因，在煙草葉面上直接施用菌液粗提液，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)煙草對PMMoV的抗性；Aalto等[10]利用噬菌體?6、T7 RNA聚合酶和RNA依賴性RNA聚合酶來大規(guī)模生產(chǎn)用于RNAi的dsRNA；解昆侖等[11]利用超聲波振碎的方法提取dsRNA，發(fā)現(xiàn)HC-Pro基因片段dsRNA對小西葫蘆黃花葉病毒病的防治效果可達(dá)95%，顯著降低植株的發(fā)病率、延遲植株發(fā)病時間?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在煙田生產(chǎn)中利用dsRNA溶液預(yù)防TMV的侵染已有研究，將菌液超聲波破碎后作為藥液施用，具有良好的防治效果[12]。對于利用小RNA測序技術(shù)探究dsRNA抑制TMV致病機(jī)理的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選高效抑制TMV侵染的dsRNA片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體實現(xiàn)該dsRNA的量化生產(chǎn)，同時利用小RNA深度測序技術(shù)探索small RNA表達(dá)特點(diǎn)。

1 材料與方法

試驗于2019—2020年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所完成。

1.1 樣品準(zhǔn)備

供試植物、菌株及質(zhì)粒：煙草花葉病毒普通株系（TMV-C）、TMV-30B侵染性克隆、本氏煙（）、三生煙（var. Samsun NN）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究中心保存。煙株均在人工氣候室中培養(yǎng)，條件為光周期L﹕D=16 h﹕8 h，25℃，光合有效輻射100 μmol·m-2·s-1，相對濕度約80%。供試大腸桿菌DH5購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌HT115、L4440質(zhì)粒由福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所饋贈。

試劑：PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pCE2 TA/Blunt-Zero vector購自諾唯贊公司；Transcription T7 Kit、S1 Nuclease、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和一步法熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒、SuperSignal West Pico Trial Kit購自Solarbio公司；異丙基--D-硫代半乳糖苷（isopropyl--D-thio-galactopyranoside，IPTG）、LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素、四環(huán)素、Tris、NaCl、EDTA、苯酚、氯仿、異戊醇、SDS、-巰基乙醇購自北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗引物于派森諾生物科技有限公司合成。

1.2 dsRNA的體外轉(zhuǎn)錄制備

根據(jù)TMV各基因功能選定CP、MP、P126、RdRP851-1238、RdRP1461-1774、RdRP1573-2330 6段序列（圖1）并設(shè)計引物（表1），通過在線BLSAT程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）進(jìn)行驗證，以避免引物序列與煙草基因組其他序列同源，利用表1所示引物對TMV基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有T7啟動子的TMV CP、MP、P126、RdRP851-1238、RdRP1461-1774、RdRP1573-2330基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物；擴(kuò)增產(chǎn)物參照TaKaRa的Transcription T7 Kit試劑盒說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄制備dsRNA。

表1 本研究所用引物

帶下劃線的堿基字母表示相應(yīng)的酶切位點(diǎn)The underlined base letters indicate the corresponding restriction sites

1.3 不同dsRNA對TMV的抑制檢測

TMV抑制試驗：以PBS處理為陰性對照，待煙株長至適當(dāng)大小，選取大小一致的同位葉，分別浸潤體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA，每株300 μg，浸潤24 h后，通過摩擦接種TMV。每個處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，25℃、16 h·d-1光照培養(yǎng)。接種后2、3 d取樣，于液氮中迅速冷凍，提取病毒接種葉片總RNA和總蛋白，于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

qRT-PCR檢測：Trizol法提取葉片總RNA后，檢測RNA濃度和純度達(dá)到預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)，合成cDNA。以為內(nèi)參，以浸潤PBS樣品的CT值為標(biāo)準(zhǔn)1，用相對CT法公式2-??CT，ABI 7500上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，計算不同處理葉片的相對RNA積累量。

Western blot檢測：提取處理葉總蛋白，保持上樣蛋白濃度一致，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜封閉1 h，按1﹕2 000稀釋TMV-CP一抗，4℃孵育過夜，按1﹕5 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，搖床上孵育2 h。TBST洗膜后涂抹發(fā)光液ECL（SuperSignal West Pico Trial Kit），于化學(xué)發(fā)光成像分析儀中成像拍照。

TMV-30B抑制試驗：為進(jìn)一步篩選TMV病毒防治中的高效dsRNA，待煙株長至適當(dāng)大小，先浸潤不同dsRNA及PBS，24 h后接種TMV-30B。25℃、16 h·d-1光照培養(yǎng)。TMV-30B接種3、5 d后，于紫外燈下觀察熒光并拍照。

三生煙枯斑試驗：為進(jìn)一步驗證TMV病毒防治中的高效dsRNA，待三生煙株長至適當(dāng)大小，先浸潤dsRNA及PBS，12 h后接種TMV病毒。TMV接毒后3 d觀察枯斑數(shù)量并拍照。

small RNA深度測序分析：本氏煙葉片分別浸潤RdRP1461-1774 dsRNA或PBS，24 h后接種TMV，接毒后72 h取浸潤葉于液氮中速凍，送美吉生物公司進(jìn)行small RNA測序，質(zhì)控合格后獲得的small RNA序列與TMV RdRP全長核酸序列進(jìn)行bowtie比對。利用比對結(jié)果，統(tǒng)計在TMV RdRP全長核酸序列上每單位長度的small RNA表達(dá)豐度count計數(shù)值并繪圖。

1.4 dsRNA的原核表達(dá)及大量制備

表達(dá)載體構(gòu)建：根據(jù)RdRP1461-1774基因片段cDNA序列及L4440載體的酶切位點(diǎn)，Premier 5.0設(shè)計擴(kuò)增引物L(fēng)4440-dsRdRP1461-1774F和L4440- dsRdRP1461-1774R及測序引物（表1），利用高保真酶擴(kuò)增 RdRP1461-1774基因片段，凝膠電泳鑒定片段長度，產(chǎn)物膠回收；回收產(chǎn)物與pCE2 TA/Blunt-Zero vector連接并轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)，陽性克隆送至派森諾生物科技有限公司測序；測序正確的克隆，抽提質(zhì)粒與L4440質(zhì)粒分別用II、Ⅰ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收大小約為381和2 624 bp目的條帶?；厥盏腄NA片段用T4酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5感受態(tài)，陽性克隆做菌液PCR，并抽提質(zhì)粒做雙酶切鑒定，鑒定正確的菌液送派森諾生物科技有限公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至HT115感受態(tài)細(xì)胞中，陽性克隆做菌液PCR，并抽提質(zhì)粒做雙酶切鑒定，鑒定正確的菌液制成甘油菌保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

重組載體誘導(dǎo)表達(dá)及提取純化：取保存的菌液接入10 mL LB培養(yǎng)基（Amp+Tet）中培養(yǎng)至OD600=0.4，加入20 μL的IPTG（終濃度為0.4 mmol·L-1）誘導(dǎo)5 h后離心去部分上清液，超聲破碎裂解細(xì)胞。以轉(zhuǎn)化空載體L4440的HT115菌液為對照，按照上述同樣的方法進(jìn)行培養(yǎng)。破碎后菌液加入500 μL 2×STE溶液（pH 8.0）、500 μL苯酚/氯仿/異戊醇（25﹕24﹕1）、15 μL-巰基乙醇、50 μL 10% SDS，渦旋3 min，8 000 r/min離心10 min，取上清用無水乙醇調(diào)至終濃度為17%，注入CF-11纖維素柱中。用含17%乙醇的1×STE溶液洗柱后，繼續(xù)用不含乙醇的1×STE溶液洗柱，于核酸紫外檢測儀下檢測并收集核酸洗脫液。洗脫液加入等體積的預(yù)冷異丙醇，-20℃沉淀30 min。12 000 r/min離心15 min，沉淀用75%乙醇洗滌，溶于30 μL無菌水，取少量電泳檢測，其余樣品于-20℃保存。

柱提dsRNA的酶解與鑒定：提取菌液核酸后，用RNase-Free DNase處理，去除殘存的DNA，然后加S1 Nuclease檢驗是否得到dsRNA，按照上述PCR方法對柱提dsRNA特異性進(jìn)行檢測。

三生煙枯斑試驗：按照上述接毒試驗操作，將柱提的核酸噴施在三生煙上，接TMV 3 d后觀察葉片上出現(xiàn)的枯斑數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 TMV dsRNA的體外轉(zhuǎn)錄制備

選取TMV（基因序列號：NC_001367.1）的全基因組序列為參考序列，圍繞TMV編碼的3個基因，設(shè)計了6對引物，通過體外轉(zhuǎn)錄分別制備6段dsRNA，即CP、MP、P126、RdRP851-1238、RdRP1461- 1774、RdRP1573-2330（圖2），片段大小分別為480、333、641、388、313和746 bp，與預(yù)期目的基因大小相符。

1: CP dsRNA; 2: MP dsRNA; 3: P126 dsRNA; 4: RdRP851-1238 dsRNA; 5: RdRP1461-1774 dsRNA; 6: RdRP1573-2330 dsRNA

2.2 不同dsRNA對TMV致病力的影響

為確定不同dsRNA對TMV的抑制效果，以TMV CP基因表達(dá)量為統(tǒng)一衡量標(biāo)準(zhǔn)，qRT-PCR檢測結(jié)果表明，與空白對照（浸潤緩沖液）相比，不同dsRNA浸潤處理后，TMV侵染第3天的葉片中病毒CP基因表達(dá)量顯著低于空白對照中TMV CP基因表達(dá)量，但不同dsRNA對病毒CP基因表達(dá)量的影響有明顯差異，其中RdRP1461-1774 dsRNA、MP dsRNA和RdRP1573-2330 dsRNA對TMV CP基因的抑制作用更顯著（圖 3）。以上結(jié)果表明，本研究設(shè)計的TMV基因組不同區(qū)域dsRNA均可提升煙株抗TMV侵染的能力，暗示在TMV侵染早期，植株葉片中浸潤dsRNA能夠抑制和延緩靶向病毒的侵染。

利用鄧肯氏多重極差測驗法進(jìn)行方差分析（SPSS 軟件），柱上不同小寫字母表示差異顯著（α=0.05）Analysis of variance (SPSS software) was conducted using Duncan’s multiple range test, different lowercase letters on the bars indicate significant difference (α=0.05)

為進(jìn)一步驗證TMV基因組不同區(qū)域dsRNA對TMV CP蛋白表達(dá)量的影響，通過Western blot技術(shù)對TMV CP蛋白表達(dá)量進(jìn)行了定量檢測分析，結(jié)果表明（圖4），TMV CP dsRNA、MP dsRNA、P126 dsRNA、RdRP851-1238 dsRNA、RdRP1461-1774 dsRNA、RdRP1573-2330 dsRNA處理后，TMV CP蛋白表達(dá)量顯著低于正常對照組的表達(dá)量，這與CP基因在RNA水平的表達(dá)趨勢基本一致。

為進(jìn)一步驗證TMV基因組不同區(qū)域dsRNA確實抑制TMV在煙草內(nèi)的侵染復(fù)制，利用TMV-30B為抑制靶標(biāo)，將CP基因水平和蛋白水平表達(dá)差異顯著性最強(qiáng)的兩個dsRNA，RdRP1461-1774 dsRNA和MP dsRNA分別浸潤煙草后，接種TMV-30B，與空白對照（浸潤緩沖液）相比，RdRP1461-1774 dsRNA和MP dsRNA兩個處理組樣本的綠色熒光區(qū)域明顯少于對照組（圖5），第5天對照組葉片開始萎蔫皺縮，而處理組未出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，說明RdRP1461-1774 dsRNA和MP dsRNA能夠延緩葉片萎蔫的時間，且RdRP1461-1774 dsRNA處理組葉片熒光區(qū)域更小。

1：Marker，2—8：分別為PBS、TMV CP dsRNA、MP dsRNA、P126 dsRNA、RdRP851-1238 dsRNA、RdRP1461-1774 dsRNA、RdRP1573-2330 dsRNA浸潤后接毒的TMV CP蛋白表達(dá)量The expression of TMV CP protein after infiltration of PBS, TMV CP dsRNA, MP dsRNA, P126 dsRNA, RdRP851-1238 dsRNA, RdRP1461-1774 dsRNA, RdRP1573-2330 dsRNA

為進(jìn)一步解釋RdRP1461-1774 dsRNA可介導(dǎo)植物降解TMV基因組核酸，對初始侵染病毒RNA具有降解作用，利用TMV免疫枯斑寄主三生煙為研究材料，浸潤RdRP1461-1774 dsRNA后，接種TMV病毒3 d后，結(jié)果顯示浸潤RdRP1461-1774 dsRNA的植株其枯斑數(shù)量明顯低于空白對照組，且邊緣并未出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象（圖6），暗示RdRP1461-1774 dsRNA可介導(dǎo)植物降解TMV侵染初始RNA。

圖5 本氏煙不同dsRNA處理后接種TMV-30B癥狀

圖6 三生煙葉片浸潤dsRNA后接種TMV 3 d的癥狀

2.3 dsRNA的原核表達(dá)及大量制備

重組構(gòu)建了L4440-dsRdRP1461-1774原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)Ⅱ和Ⅰ雙酶切后，可分別檢測到約381、2 624 bp目的條帶（圖7中1泳道），片段大小與預(yù)期相符，結(jié)合序列測定，顯示RdRP1461- 1774 dsRNA原核表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。RdRP1461-1774 dsRNA原核表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DE3感受態(tài)細(xì)胞中，通過IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，與L4440空載體對照相比，由含重組L4440- dsRdRP1461-1774表達(dá)載體的菌液所提取的核酸經(jīng)RNase-Free DNase和S1 Nuclease消化處理（圖7中2—6泳道），目的條帶（約400 bp處）明顯，證明L4440-dsRdRP1461-1774菌液經(jīng)誘導(dǎo)后成功表達(dá)出dsRNA，大小約為381 bp，PCR結(jié)果顯示有特異性目的條帶（圖7中7泳道），以上結(jié)果證明RdRP1461-1774 dsRNA可通過原核表達(dá)體系實現(xiàn)大量制備和工業(yè)化生產(chǎn)。柱提的核酸噴施在三生煙葉上接種TMV 3 d后，處理組僅出現(xiàn)零星的斑點(diǎn)，而對照組葉片出現(xiàn)大范圍密集斑點(diǎn)，處理組葉片枯斑數(shù)量少于對照組葉片（圖8）。

Marker：2000 bp DNA marker；1：L4440-dsRdRP1461-1774重組載體的雙酶切驗證Identification of L4440-dsRdRP1461-1774 recombinant vector by double restriction endonuclease digestion；2：L4440-dsRdRP1461-1774菌液提取的核酸Nucleic acid extracted from L4440-dsRdRP1461-1774 bacterial solution；3：RNase-Free DNase處理過的L4440-dsRdRP1461-1774菌液核酸RNase-Free DNase treated L4440-dsRdRP1461-1774 bacterial solution nucleic acid；4：S1 Nuclease處理過的L4440-dsRdRP1461-1774菌液核酸S1 Nuclease treated L4440-dsRdRP1461-1774 bacterial solution nucleic acid；5：RNase-Free DNase、S1 Nuclease處理過的L4440- dsRdRP1461-1774菌液核酸RNase-Free DNase, S1 Nuclease treated L4440-dsRdRP1461-1774 bacterial solution nucleic acid；6：RNase-Free DNase、S1 Nuclease處理過的L4440菌液核酸樣品RNase-Free DNase, S1 Nuclease-treated L4440 bacterial solution nucleic acid sample；7：菌液PCR檢測 Fragments amplified by PCR from bacterial culture

圖8 TMV接種3 d后的枯斑三生煙

2.4 RdRP1461-1774 dsRNA噴施煙草后生成的siRNA分析

近年來的小RNA組的高通量深度測序結(jié)果表明，植物細(xì)胞中80%以上的小RNA為siRNA[13]，因此，為解釋RdRP1461-1774 dsRNA通過物理浸潤可在葉面內(nèi)實現(xiàn)RNAi，以浸潤PBS后TMV侵染煙葉為對照，通過small RNA深度測序，對RdRP1461- 1774 dsRNA浸潤后接毒葉片進(jìn)行了分析，正值和負(fù)值分別代表從正義鏈和反義鏈中提取的small RNA的覆蓋數(shù)。結(jié)果顯示，PBS浸潤接毒后產(chǎn)生的小RNA峰度值為6 000（圖9-A），而外源RdRP1461-1774 dsRNA浸潤接毒后峰度值高達(dá)90 000（圖9-B）。對照組的siRNA是由TMV感染引入的dsRNA前體加工而來，測序結(jié)果中正義鏈和反義鏈以大致相等的頻率產(chǎn)生siRNA（圖9-A），而RdRP1461-1774 dsRNA浸潤處理組中，靶向核苷酸區(qū)域的small RNA峰度值顯著高于對照組峰度值。以上數(shù)據(jù)證明Dicer酶成功酶解dsRNA，產(chǎn)生了大量siRNA，呈現(xiàn)高峰值表達(dá)。另外由圖9-B可知，外源dsRNA浸潤接毒后siRNA的反義鏈累積量驟增，對應(yīng)的正義鏈累積量驟減。

圖9 small RNA測序與個性化分析圖

3 討論

RNAi技術(shù)在病毒防治方面早有研究[12,14]，但在將這些應(yīng)用產(chǎn)業(yè)化之前，對于高效作用片段的篩選研究較少，靶片段的選取仍然是RNAi的重點(diǎn)，在很大程度上影響RNAi的效果。本研究所使用的病毒靶標(biāo)基因篩選的方法，可以作為同類型RNAi防治病毒病的方法參考，通過比較基因功能獲得一批候選的dsRNA后，用生物學(xué)方法評估其抗病毒能力，在此基礎(chǔ)上篩選高效降解TMV靶向核酸的dsRNA，最終篩選出TMV基因組中RdRP基因上一段長313 bp的高效作用片段。病毒核酸復(fù)制酶的核心功能是合成全長的病毒基因組RNA，是特異性依賴于病毒RNA的RNA聚合酶（RdRP）[15]，有研究表明與植物病原病毒外殼蛋白相比，轉(zhuǎn)病毒的復(fù)制酶基因能夠賦予感病寄主植物相對較高的抗病毒能力[16]，推測干擾RdRP段基因能夠更好地抑制病毒的侵染[17]，該片段dsRNA能夠高效與靶基因結(jié)合，降低染病植株TMV的表達(dá)量，實現(xiàn)對植株的靶向RNAi保護(hù)。

利用RNAi技術(shù)防治植物病毒病，防治效果首先取決于高效dsRNA片段的篩選，另外如何將dsRNA高效遞送至植物體內(nèi)也是近年來的研究熱點(diǎn)[18-19]。植物體內(nèi)dsRNA酶解為小RNA誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的沉默，引起植物抗病毒的RNAi過程[20]。雙鏈RNA被Dicer識別降解，不會被翻譯成蛋白質(zhì)，避免了外源蛋白質(zhì)在植株體內(nèi)的積累，具有較高的生物安全性[21]。酶解成的siRNA一條鏈與AGO蛋白形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，復(fù)合體通過堿基互補(bǔ)配對識別靶基因，介導(dǎo)降解、翻譯抑制或組蛋白甲基化等，導(dǎo)致特異性的基因沉默，即使互補(bǔ)區(qū)不完全配對，也會導(dǎo)致翻譯抑制[22]。而小RNA不僅可以從外源基因的表達(dá)中獲得，植物本身也會產(chǎn)生內(nèi)源RNA[23]。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來越多的內(nèi)源性小RNA。這類小RNA前體一般有兩種來源，一種是互補(bǔ)DNA的區(qū)段分別被轉(zhuǎn)錄下來形成的正義、反義雙鏈，或者從染色體上不同位置轉(zhuǎn)錄來的互補(bǔ)雙鏈[24]，總之合成dsRNA的雙鏈均是從基因組上復(fù)制下來，天然存在并互補(bǔ)，這種轉(zhuǎn)錄途徑一般在高鹽或者細(xì)菌病原體入侵時被誘導(dǎo)產(chǎn)生，當(dāng)病毒成功侵染植物細(xì)胞后，病毒的核酸需要利用植物的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)完成自我復(fù)制，病毒侵染的植物細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生病毒來源的小分子RNA（vsiRNA），vsiRNA對于宿主基因表達(dá)的調(diào)控程度可能取決于vsiRNA的豐度[25]，本研究的測序結(jié)果也顯示TMV侵染時正義鏈和反義鏈以大致相等的頻率產(chǎn)生小RNA，小RNA參與了植物的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，作為效應(yīng)分子在病毒進(jìn)入植物體內(nèi)后利用RNAi機(jī)制沉默病毒靶基因[26]。將RNAi技術(shù)應(yīng)用于煙草抗TMV基因工程研究，必定會帶動其他植物抗病毒的相關(guān)理論問題和應(yīng)用實踐研究。

利用T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA是目前的主流合成技術(shù)，但該技術(shù)生產(chǎn)dsRNA具有成本高，操作繁瑣等特點(diǎn)，嚴(yán)重限制了dsRNA的量化生產(chǎn)?？紤]到體外轉(zhuǎn)錄制備的dsRNA量非常少，滿足不了田間病毒防治的劑量需求，為此，針對RdRP1461-1774 dsRNA開展了原核表達(dá)體系構(gòu)建，以期實現(xiàn)低成本制備[27-28]，利用原核表達(dá)技術(shù)實現(xiàn)dsRNA的高效量產(chǎn)。利用原核系統(tǒng)表達(dá)dsRNA來干擾病毒的侵染，減輕病毒病的危害，通過葉面噴施dsRNA來防治病毒病是一種環(huán)境友好型思路[29]，符合當(dāng)下對綠色農(nóng)業(yè)的推進(jìn)政策。本研究僅限于浸潤及噴施裸dsRNA的方法來防治病毒病，針對dsRNA可能存在的降解問題，后續(xù)可以考慮用納米材料修飾以提高其穩(wěn)定性[30]，針對田間生長時常有多種病毒病混合發(fā)生的現(xiàn)象，也可以考慮混合多種病原dsRNA，防治多種病毒病，更加利于推廣[31]。

4 結(jié)論

通過比較dsRNA介導(dǎo)植物靶向抗TMV侵染的效果，最終選定TMV基因中RdRP基因上一段長313 bp的高效作用片段RdRP1461-1774。同時構(gòu)建了RdRP1461-1774基因片段的dsRNA原核表達(dá)系統(tǒng)，實現(xiàn)其低成本的高效量產(chǎn)，為后續(xù)研究dsRNA誘導(dǎo)RNAi防治植物病毒病提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。通過小RNA深度測序技術(shù)，對外源性dsRNA干擾TMV侵染機(jī)理進(jìn)行了探究，明確dsRNA通過物理浸潤可在葉面內(nèi)實現(xiàn)RNAi全過程，且物理浸潤的外源性dsRNA會改變TMV侵染的small RNA表達(dá)特征和富集帶。

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Screening and large-scale preparation of dsRNA for highly targeted degradation of tobacco mosaic virus (TMV) nucleic acids

XU Xiang1, XIE Yi1, SONG LiYun1, SHEN LiLi1, LI Ying1, WANG Yong2, LIU MingHong3, LIU DongYang2, WANG XiaoYan3, ZHAO CunXiao4, WANG FengLong1, YANG JinGuang1

1Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong;2Liangshan Company, SichuanTobacco Company, Xichang615000, Sichuan;3Zunyi City Company, Guizhou Tobacco Company, Zunyi 563000, Guizhou;4Qingyang Tobacco Company of Gansu Provincial Company, Qingyang 745099, Gansu

【】The objective of this study is to screen the dsRNAs with high efficiency and targeting degradation of tobacco mosaic virus(TMV), achieve its mass preparation, and to explore the mechanism.【】Using CP, MP and RdRp genes encoded by TMV as target sequences, dsRNAs were synthesizedand infiltrated into. After 24 h, TMV was inoculated, total RNA and protein were extracted from samples 2 and 3 d after TMV inoculation, and the mRNA level and protein level of CP gene were used as indicators, combined with the biological symptoms of TMV, to comprehensively evaluate the inhibitory effect of each dsRNA on TMV. The fluorescence expression of TMV-30B onand the hypersensitive necrosis reaction of TMV onvar. Samsun NN were also combined. The dsRNA fragments that efficiently inhibit TMV were screened by comparing the dsRNAs corresponding to the six target sequences on the TMV genome. In order to obtain a large number of dsRNAs, the corresponding gene fragments of dsRNAs were inserted between the double T7 promoters of the prokaryotic expression vector L4440 and transformed into RNase III deficientHT115 (DE3). And the siRNA generated after the prepared dsRNA spraying on tobacco was deeply sequenced to compare the effect of exogenous application of dsRNA on the small RNA expression characteristics and enrichment bands of TMV infestation.【】RdRP1461-1774 dsRNAs with high effect on TMV CP gene expression were screened, and l4440-dsRdRP1461-1774 prokaryotic expression vector was constructed, which could induce the formation of target dsRNAs. The dsRNA extracted from bacteria solution could significantly inhibit TMV, when TMV-30B was applied to infect tobacco, the number of fluorescence decreased, the time of leaf wilting prolonged, and the number of necrosis spots decreased significantly. The results of small RNA sequencing showed that in the RNAi process induced by TMV infection, the sense and antisense chains produced siRNA with approximately equal frequency, while the infiltration of exogenous dsRNA resulted in the enrichment of siRNA in the target area, and the accumulation of antisense chain of siRNA increased sharply, the cumulative value of the corresponding sense chain decreased sharply. The application of exogenous dsRNA could change the abundance of siRNA expression.【】The targeted anti-TMV dsRNA sequences were screened by comparing the effects of dsRNA on the targeted anti-TMV infection in plants. Finally, a 313 bp long effective segment of RdRP gene was selected. This fragment of dsRNA can efficiently bind to the target gene and reduce the expression of TMV in infected plants. At the same time, a dsRNA prokaryotic expression system of RdRP1461-1774 gene was constructed to achieve low-cost and high-efficiency production, which provided the basis for the follow-up application of dsRNAs in the control of plant virus.

tobacco mosaic virus(TMV); RNA interference (RNAi); dsRNA; small RNA sequencing; prokaryotic expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.006

2020-06-10；

2020-07-11

煙草綠色防控重大專項（110201901041（LS-04））、四川省煙草公司科技項目（SCYC201804，SCYC202008）、甘肅省煙草公司科技項目（201862100020017，201862100020016）、貴州省煙草公司科技項目（201921）

徐翔，E-mail：17854233569@163.com。通信作者王鳳龍，E-mail：wangfenglong@caas.cn。通信作者楊金廣，E-mail：yangjinguang@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）