龐 嵐，曾 倩，武學(xué)鋒，申 艷，李軍澎

(1. 邯鄲市婦幼保健院，河北 邯鄲 056000；2. 邯鄲市中心血站，河北 邯鄲 056000；3. 涉縣婦幼保健院，河北 涉縣 056400)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)達(dá)國(guó)家惡性婦科腫瘤死亡的主要原因之一。 在中國(guó),子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生在年輕人中更為常見(jiàn)，并表現(xiàn)出發(fā)病率和病死率逐步增高的趨勢(shì)[1]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，在子宮內(nèi)膜單純性增生逐漸進(jìn)展為非典型增生期間以及早期子宮內(nèi)膜癌向晚期癌進(jìn)展過(guò)程中多種分子均發(fā)生了變化[2]。因此，鑒定與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的高度敏感和特異性分子標(biāo)志物可以對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的正確診斷和治療提供巨大幫助。轉(zhuǎn)移黏附蛋白(AEG-1)為HIV-1感染后人胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的新型晚期反應(yīng)基因。Song等[3]發(fā)現(xiàn)AEG-1的過(guò)表達(dá)與人非小細(xì)胞肺癌的腫瘤侵襲性和預(yù)后不良密切相關(guān)，且AEG-1可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、自噬和血管生成，并在很多癌癥轉(zhuǎn)移、恢復(fù)和化學(xué)抗性中發(fā)揮重要作用[4-6]，但有關(guān)其參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過(guò)程的機(jī)制研究仍然有限，尤其是其表達(dá)量變化與子宮內(nèi)膜癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)性報(bào)道少見(jiàn)。因此，本研究觀察了AEG-1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其表達(dá)量與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步明確子宮內(nèi)膜癌病理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1一般資料 收集2016年7月—2018年7月在邯鄲市婦幼保健院接受手術(shù)的48例子宮內(nèi)膜癌患者組織標(biāo)本、28例子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織標(biāo)本和30例正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本。子宮內(nèi)膜癌患者年齡32～63歲；手術(shù)后病理確認(rèn)為子宮內(nèi)膜腺癌；FIGO病理分期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ期9例；組織學(xué)分級(jí)：G1+G2級(jí)39例，G3級(jí)9例；淋巴轉(zhuǎn)移8例，無(wú)轉(zhuǎn)移40例。子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織標(biāo)本和正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本均來(lái)自門(mén)診刮宮者。本研究經(jīng)邯鄲市婦幼保健院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2研究方法 測(cè)定各組織中AEG-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表達(dá)量，分析二者表達(dá)量與子宮內(nèi)膜癌患者病理特征的關(guān)系；檢測(cè)各組織中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、CUL4A的mRNA表達(dá)量，Pearson分析AEG-1與MMP-9蛋白、β-catenin mRNA、CUL4A mRNA表達(dá)的相關(guān)性。

1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1AEG-1和MMP-9蛋白表達(dá)Western印跡法檢測(cè) 樣本裂解后，4 ℃下13 000 r/min離心15 min取上清液，應(yīng)用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)量試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，加入5×SDS樣品緩沖液，隨后加入終濃度為5%的β-巰基乙醇(南京森北佳生物科技有限公司)使蛋白變性。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量，制備12%分離凝膠和5%間隔凝膠(所有試劑購(gòu)自德國(guó)Amresco公司)。使用PVDF膜和切成相同尺寸的6片濾紙進(jìn)行膜轉(zhuǎn)移。甲醇浸泡PVDF膜后，加入緩沖溶液并將膜置于具有冰塊的盆中300 mAmp電泳1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜后應(yīng)用TBS-T配置的10%牛奶進(jìn)行封閉，隨后孵育AEG-1和MMP-9一抗4 ℃過(guò)夜。次日洗滌后孵育二抗室溫1 h后ECL顯影檢測(cè)。 采用Quantity One軟件分析計(jì)算AEG-1、MMP-9表達(dá)量。

1.3.2β-catenin和CUL4A mRNA RT-PCR檢測(cè) 按照Trizolextraction 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行總RNA提取。組織經(jīng)勻漿、離心、與異丙醇混合、冰乙醇洗滌后，分光光度法檢測(cè)RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將1 μg RNA與水和dT引物混合，在30 ℃下加熱10 min，在DNTPs逆轉(zhuǎn)錄酶和含有MgCl2(5 mmol/L)緩沖液下42 ℃溫育30 min。99 ℃加熱5 min終止反應(yīng)，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將總?.5 μL cDNA與水、引物和聚合酶混合進(jìn)行PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)的總體積為20 μL。引物序列和擴(kuò)增條件：β-catenin上游為5’-TGGCAGCAACAGTCTTACC-3’，下游為5’-TCCACATCCTCTTCCTCAG-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度112 bp，退火溫度72 ℃；CUL4A上游為5’-CAGCGGCTCTGATTACAGACCTCG-3’，下游為5’-GTCTTCACAGGCCTGACGCAGT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度121 bp，退火溫度65 ℃；GAPDH上游為5’-AGTTATTGTGTGCTGGGGACA-3’，下游為5’-CAGGCTCCAGSSGAAGTTGG-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度309 bp，退火溫度62 ℃。

2 結(jié) 果

2.1AEG-1和MMP-9蛋白表達(dá)情況 AEG-1蛋白在78 kD處出現(xiàn)，MMP-9蛋白在92 kD處存在，β-actin在43 kD處存在。子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1和MMP-9蛋白表達(dá)量均較子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織和正常子宮內(nèi)膜組織中高(P均<0.05)，子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織中較正常內(nèi)膜組織中高(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各子宮內(nèi)膜組織中AEG-1和MMP-9蛋白表達(dá)情況

2.2AEG-1和MMP-9蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關(guān)系 AEG-1和MMP-9蛋白表達(dá)與肌層浸潤(rùn)、病理分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，在高病理分期、肌層浸潤(rùn)深度≥1/2和淋巴轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)量更高(P均<0.05)，但與組織學(xué)分級(jí)和年齡無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AEG-1及MMP-9 蛋白表達(dá)量與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3β-catenin和CUL4A mRNA水平表達(dá)情況 子宮內(nèi)膜癌組織中β-catenin和CUL4A mRNA表達(dá)量均較子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織和正常子宮內(nèi)膜組織中高(P均<0.05)，子宮內(nèi)膜單純?cè)錾M織中β-catenin mRNA表達(dá)量較正常內(nèi)膜組織中高(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各子宮內(nèi)膜組織中 β-catenin和CUL4A mRNA表達(dá)情況

2.4AEG-1與MMP-9 蛋白及β-catenin mRNA和CUL4A mRNA表達(dá)的相關(guān) Pearson相關(guān)分析顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1表達(dá)量和MMP-9蛋白表達(dá)量(r=0.970，P<0.001)、β-catenin mRNA表達(dá)量(r=0.611，P=0.032)、CUL4A mRNA表達(dá)量(r=0.603，P=0.020)均呈顯著正相關(guān)。

3 討 論

AEG-1作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新型基因，已發(fā)現(xiàn)其在各種癌癥中過(guò)度表達(dá)，并參與腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。在肺癌細(xì)胞中，AEG-1的mRNA表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞系，其高表達(dá)與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。Zhou等[9]發(fā)現(xiàn)AEG-1在高轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞系中高表達(dá)，而AEG-1的表達(dá)與人肝癌細(xì)胞系的定向趨化性和黏附性呈正相關(guān)。 Wei等[10]發(fā)現(xiàn)AEG-1可以作為致癌基因，抑制AEG-1的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞活力并削弱前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力。在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，AEG-1可通過(guò)上調(diào)eIF4E/cyclin D1信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)[11]。在非小細(xì)胞肺癌的腫瘤發(fā)生和惡化中，AEG-1也被顯著激活，且可能通過(guò)AMPK信號(hào)通路發(fā)揮重要作用[12]。與上述研究相似，本研究發(fā)現(xiàn)AEG-1在子宮內(nèi)膜癌組織中呈高表達(dá)，并與淋巴轉(zhuǎn)移和病理嚴(yán)重性顯著相關(guān)。表明AEG-1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但其具體機(jī)制仍需在細(xì)胞水平進(jìn)一步研究。

MMPs屬于蛋白水解酶，主要為細(xì)胞外基質(zhì)分子的釋放，其可影響細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分受體細(xì)胞活性的某些方面功能，例如ECM降解、細(xì)胞增殖、黏附和遷移[13]。已有研究證實(shí)，MMP可調(diào)節(jié)和控制腫瘤血管生成，是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要因素[14]。MMP-9為MMPs家族重要一員，其可使基底膜中的膠原蛋白Ⅳ退化，以促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[15]，且在一些腫瘤如膀胱癌和宮頸癌中具有預(yù)測(cè)預(yù)后價(jià)值[6-7]。因此，MMP-9可作為評(píng)估癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移情況的代表因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中MMP-9蛋白表達(dá)量明顯增高,子宮內(nèi)膜癌組織中AEG-1和MMP-9蛋白高表達(dá)與病理嚴(yán)重程度、淋巴轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)均顯著相關(guān)，且AEG-1與MMP-9二者表達(dá)也呈現(xiàn)正相關(guān)性。Liu等[16]在乳頭狀甲狀腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，敲低AEG-1會(huì)通過(guò)下調(diào)癌細(xì)胞中MMP-2/9表達(dá)而降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。綜上提示，AEG-1高表達(dá)可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移和侵襲，AEG-1可能通過(guò)影響MMP-9表達(dá)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程。

β-catenin作為Wnt信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在很多研究中已被證實(shí)其活化可引起腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖以及血管發(fā)生[17]。CUL4A 是新發(fā)現(xiàn)的CRLs泛素連接酶，位于癌基因高表達(dá)區(qū)域，參與癌細(xì)胞的遷移、侵襲過(guò)程[18]。因此，本研究同時(shí)檢測(cè)了子宮內(nèi)膜癌組織中代表性侵襲基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中β-catenin及CUL4A mRNA表達(dá)量均顯著增高，Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)AEG-1表達(dá)與β-catenin和CUL4A mRNA表達(dá)均呈顯著正相關(guān)，表明AEG-1的異常表達(dá)可直接影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中存在AEG-1異常高表達(dá)，其可影響相關(guān)侵襲、轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)及過(guò)程，從而影響子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。