樊 榮,李 龍,喬中原,王俊平,張 琪,馬 磊

(1.西安市第一醫(yī)院，陜西 西安 710002； 2. 西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院，陜西 西安 710002；3. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004)

隨著我國步入老齡化社會，心血管疾病的發(fā)病率逐漸升高。雖然心臟手術(shù)可延緩一些心臟相關(guān)致死疾病的發(fā)生，但是在手術(shù)后缺血再灌注給心肌帶來的損傷不可避免[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類藥物預(yù)防給藥可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷造成的心肌損害[2-3]。白楊素是黃酮類化合物的一種，化學(xué)名為5，7-二羥基黃酮，其首先于紫葳科植物木蝴蝶中被發(fā)現(xiàn)，而在蜂膠中廣泛存在。相關(guān)文獻(xiàn)報道，白楊素可明顯減輕炎癥反應(yīng)，提高機體抗氧化能力，對心肌具有一定的保護作用[4-5]，但是其用于心肌缺血再灌注損傷的研究少見。為此本研究構(gòu)建了心肌缺血再灌注損傷動物模型，觀察了白楊素對心肌損傷是否有保護作用，并嘗試從Nrf2/HO-1信號通路闡明其作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物 SPF級雄性SD大鼠60只，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，動物合格證號：SYXK(陜)2018-001，動物購買后飼養(yǎng)于實驗中心，5只/籠，由實驗中心專業(yè)人員統(tǒng)一喂養(yǎng)和管理。

1.1.2藥物與試劑 白楊素(98%)由陜西慈緣生物技術(shù)有限公司提供； 雷米普利購于昆山龍燈瑞迪制藥有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧簇(ROS)試劑盒購于武漢博士德生物科技公司；核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于Abcam公司，辣根酶標(biāo)記的二抗購于武漢谷歌生物科技有限公司，引物由上海生物生工生產(chǎn)。

1.1.3儀器 全自動生化分析儀(C8000型，美國雅培公司)；酶標(biāo)儀[Infinite F50型，勒菲生物科技(上海)有限公司]；紫外可見分光光度計(919型，德國MACHEREY-NAGEL公司)；低溫高速離心機(TDL80型，德國BC公司)；-86 ℃超低溫冰箱(DW-HL678型，美菱生物醫(yī)療)；凝膠電泳儀系統(tǒng)(BR型，美國Bio-Rad公司)；實時熒光定量PCR儀(QuantStudio 3型，賽默飛世爾中國)。

1.2實驗方法

1.2.1分組及干預(yù) 按照隨機數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、雷米普利組、白楊素低劑量組、白楊素中劑量組和白楊素高劑量組，每組10只。分組適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，雷米普利組給予雷米普利1.0mg/(kg·d)灌胃，白楊素低、中、高劑量組分別給予白楊素10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，均灌胃2周。

1.2.2心肌缺血再灌注損傷模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[6]中方法造模：實驗開始時所有大鼠禁食不禁水12 h，后分批次給予1%的戊巴比妥鈉5 mL/kg 腹腔注射麻醉，麻醉后將其固定于解剖版，氣管插管、連接動物呼吸機，連接并檢測心電圖。后沿胸左側(cè)第三和第四肋骨之間行開胸手術(shù)，分離包膜后充分暴露心臟，剪開心包膜，采用無損傷縫線在平左心耳下緣1～1.5 mm 處進針，后沿左前降支后出針，拉緊結(jié)扎線行結(jié)扎手術(shù)(假手術(shù)組不結(jié)扎)，當(dāng)肉眼可見有明顯左心室蒼白，同時心電圖ST段抬高即達(dá)到缺血目的。于結(jié)扎30 min后，恢復(fù)供血120 min即再灌注損傷模型造模成功。

1.2.3血液和組織收集 再灌注結(jié)束后，用注射器抽取股動脈血液約5 mL，一部分置入抗凝管中完成心肌酶檢測，其余采用低溫高速離心機離心(4 ℃，3 000 r/min，15 min)后收集血清，置入超低溫冰箱備用；取出心臟，將心臟橫切，一部分置入組織固定液中固定，一部分置入超低溫冰箱中備用。

1.3檢測指標(biāo)與方法

1.3.1心肌組織HE染色病理學(xué)觀察 參考文獻(xiàn)[7]方法，取出組織固定液固定后的心肌組織標(biāo)本，依次經(jīng)包埋、切片、洗滌、蘇木精染色、伊紅復(fù)染、脫水、封片后，采用熒光倒置顯微鏡觀察，每張切片隨機選取4個不同的視野。

1.3.2生化指標(biāo)檢測 采用雙抗體夾心法測定血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、血漿肌鈣蛋白 I(cTnI)水平，根據(jù)試劑盒說明書測定血液和心肌組織中氧化和抗氧化指標(biāo)SOD、MDA和ROS水平。

1.3.3心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測：從超低溫冰箱中取出心臟組織，稱取100 mg后置入離心管中，加入1 mL組織裂解液將其充分?jǐn)f磨，提取上清后定量并調(diào)平，然后每組各取50 μg行聚丙烯酰氨凝膠電泳，完成后切取目的蛋白，采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗孵育，洗滌后加入二抗孵育，暗室曝光洗片即可。采用Image 軟件分析結(jié)果，以觀察指標(biāo)的灰度值與 β-actin 條帶灰度值的比值作為蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.4心肌組織中Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)檢測 稱取20 mg心肌組織，采用試劑盒提取總RNA后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，每組各取2 μL行擴增反應(yīng)，擴增條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)，以GAPDH作內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct法比較分析。引物序列：Nrf2上游引物為5’-CGGCTAGATGGCTAACTGAGTGGC-3’，下游引物為5’-GATTTGGCGATTGCTGCTCAGC-T-3’，產(chǎn)物長度為86bp；HO-1 上游引物為5’-TCCATGGGTTTGCCACACTC-3’， 下游引物為5’-AAGAGCCAAGCAAAGGCGA-3’，產(chǎn)物長度為98 bp；GAPDH上游引物為5’-GGACTAGCTACTGACCC-TC-3’，下游引物為5’-TACCCTGGCTCTTTGAT-3，產(chǎn)物長度為117 bp。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn) 假手術(shù)組大鼠心肌纖維完整，基本沒有斷裂，纖維排列整齊；模型組出現(xiàn)明顯心肌纖維排列紊亂和斷裂，各藥物組心肌組織病變程度明顯輕于模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.2各組大鼠血清心肌酶學(xué)指標(biāo)比較 模型組大鼠血清CK、CK-MB、LDH和cTnI水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，各藥物組上述指標(biāo)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且白楊素高劑量組LDH水平明顯低于雷米普利組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清心肌酶學(xué)指標(biāo)比較

2.3各組大鼠血清和心肌組織中氧化和抗氧化指標(biāo)水平比較 模型組大鼠血清和心肌組織中MDA和ROS水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，SOD水平均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)；各藥物組大鼠血清和心肌組織中MDA和ROS水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，SOD水平均明顯高于模型組(P均<0.05)；白楊素高劑量組血清和心肌組織中MDA、ROS水平及白楊素中劑量組血清和心肌組織中ROS水平均明顯低于雷米普利組(P均<0.05)。見表2和表3。

表2 各組大鼠血清氧化和抗氧化指標(biāo)水平比較

表3 各組大鼠心肌組織中氧化和抗氧化指標(biāo)水平比較

2.4各組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)情況比較 模型組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，各藥物組上述指標(biāo)均明顯高于模型組(P均<0.05)；白楊素中、高劑量組Nrfz蛋白表達(dá)量和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯高于雷米普利組(P均<0.05)，且白楊素高劑量組Nrfz mRNA表達(dá)量明顯高于雷米普利組(P<0.05)。見圖2和表4。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為雷米普利組；D為白楊素低劑量組；E為白楊素中劑量組；F為白楊素高劑量組圖2 各組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)灰度圖

表4 各組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

缺血再灌注損傷是心肌梗死手術(shù)治療中常見的并發(fā)癥，其嚴(yán)重影響患者預(yù)后[8]，因此對缺血再灌注損傷的及早預(yù)防或在發(fā)生后積極治療非常重要。

黃酮是許多植物藥的有效活性藥理成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、有效保護心肌、抵抗糖尿病肝臟和腎臟損傷等多種生物活性[9-11]。白楊素是天然黃酮類化合物的一種，其可促進腫瘤細(xì)胞凋亡，還可抑制病態(tài)血管生成，抗高血壓、降血糖等[12-15]，但其對心肌缺血再灌注損傷是否有保護作用尚不明確。本實驗觀察了白楊素預(yù)防給藥對心肌損傷的保護作用，病理結(jié)果顯示各藥物組大鼠心肌損傷均較模型組減輕，提示白楊素對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌具有一定的保護作用。

心肌酶譜是臨床中判斷心肌損傷程度的一類核心指標(biāo)，主要包括LDH、CK、CK-MB、α-HBD和cTnI等[16]。在正常生理條件下，血清心肌酶水平較低，而在缺血再灌注損傷發(fā)生后，心肌細(xì)胞受到損失會導(dǎo)致相關(guān)心肌酶釋放入血液而升高。此外心肌細(xì)胞受損后許多活性氧自由基包括MDA和ROS也可釋放到血液中[17]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠血清LDH、CK、CK-MB、cTnI水平及血液和心肌組織中MDA、ROS水平均明顯升高，而各藥物組上述指標(biāo)水平均明顯低于模型組；模型組大鼠血液和心肌組織中SOD水平均明顯降低，而各藥物組均明顯高于模型組。提示白楊素預(yù)防給藥可以明顯提高缺血再灌注損傷大鼠心肌抗氧化能力，保護心肌。

Nrf2-ARE信號通路主要調(diào)控SOD和GSH等抗氧化酶系的表達(dá)，與機體氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[18]。缺血再灌注損傷發(fā)生后，MDA和ROS等過量表達(dá)可引起Nrf2蛋白和Keapl蛋白解耦聯(lián)，Nrf2蛋白在解耦聯(lián)后可進入細(xì)胞核，激活一些抗氧化因子如HO-1的表達(dá)，進而提高機體的抗氧化能力[19]。HO-1是機體最主要的內(nèi)源性保護酶，其可以促進SOD和GSH生成，進而保護細(xì)胞免受氧化損傷[20-21]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組，各藥物組上述指標(biāo)表達(dá)量均明顯高于模型組。這提示在心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后，機體本身有一定的自我調(diào)節(jié)能力，而白楊素預(yù)防給藥能夠進一步提高心肌組織抗氧化能力，進而保護心肌。

綜上所述，白楊素預(yù)防給藥可明顯改善心肌缺血再灌注造成的心肌損傷，可能與其可提高心肌組織中Nrf2和HO-1表達(dá)，進而提高心肌抗氧化能力有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。