米垚川， 溫濱紅

遼寧省人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

成人的血管平滑肌細(xì)胞的主要功能是維持血管收縮并控制血管直徑，以調(diào)節(jié)血壓的血流分布[1-2]。收縮表型的血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)分化標(biāo)志物如α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，是血管平滑肌細(xì)胞維持收縮表型的必需蛋白[3]。當(dāng)受到高糖、高血脂及高血壓等病理因素刺激時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞表現(xiàn)出顯著可塑性，從收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，其特征是收縮型蛋白的表達(dá)降低以及合成型蛋白的表達(dá)增加[4-5]。血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病有關(guān)，后者為2型糖尿病的重要并發(fā)癥之一[6]。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是一種配體門控非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白，對(duì)Na+，Ca2+和Mg2+等離子具有顯著的通透性[7]。在改善動(dòng)脈粥樣硬化方面，TRPV1發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[8-9]。但目前關(guān)于TRPV1是否影響由高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換鮮有報(bào)道?；诖?，本研究以期通過實(shí)驗(yàn)闡明TRPV1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用與機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 健康8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠20只，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量(23.00±0.23)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及保護(hù)相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要材料及試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自Invitrogen公司；青鏈霉素混合液、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；葡萄糖試劑購(gòu)自Sigma公司；TRPV1、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、α-SMA抗體均購(gòu)自Abcam公司；過表達(dá)腺病毒載體AdTRPV1(病毒滴度為1.4×1010PFU/ml)、陰性對(duì)照腺病毒載體AdGFP購(gòu)自和元生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 原代血管平滑肌細(xì)胞分離和培養(yǎng) 組織貼塊法培養(yǎng)小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞：小鼠麻醉后處死，置入酒精缸中消毒3 min，后置于無(wú)菌手術(shù)臺(tái)，充分顯露胸腹部后用眼科剪切開皮膚；打開胸腔，選取主動(dòng)脈弓到腹主動(dòng)脈的血管，PBS反復(fù)沖洗后，去除血管外的結(jié)締組織及脂肪組織，并在剪開血管后刮除內(nèi)皮細(xì)胞；再次PBS沖洗，將剩余的血管剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，將組織塊平均分布在培養(yǎng)皿底部，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基4 ml，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中；4～6 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基8 ml，靜置培養(yǎng)4～5 d，每3 d換液1次，觀察血管平滑肌細(xì)胞從組織塊遷出的情況并傳代培養(yǎng)。取第3代以后血管平滑肌細(xì)胞種植于6孔板中，分別轉(zhuǎn)染AdTRPV1或AdGFP，24 h后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后，利用2.5 μl移液器槍頭垂直均勻劃痕，后采用2.0 ml PBS清洗。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞通過給予25 mmol/L葡萄糖持續(xù)48 h形成高糖刺激；通過給予5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇持續(xù)48 h形成對(duì)照。即血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdTRPV1或AdGFP后，再通過高糖刺激或?qū)φ仗幚恚罱K分為4組：AdTRPV1對(duì)照組、AdGFP對(duì)照組、AdTRPV1+高糖組與AdGFP+高糖組。分別于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)0、24 h后，顯微鏡下觀察并拍照記錄。每次顯微鏡觀察前用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗，除去細(xì)胞碎片。根據(jù)公式：細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.5 Western blotting法檢測(cè)TRPV1及相關(guān)表型轉(zhuǎn)換蛋白表達(dá) 血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)過處理后，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部刮下，轉(zhuǎn)移至EP管中，加入裂解液，提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行定量，計(jì)算并配置相應(yīng)的上樣量，通過10% SDS-PAGE凝膠行蛋白電泳，蛋白分離后常規(guī)轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，第2天TBST洗滌3次，加入對(duì)應(yīng)的二抗后室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，采用Amersham Imager 680化學(xué)發(fā)光成像儀掃描并記錄分析條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞遷移率比較 AdGFP對(duì)照組與AdTRPV1對(duì)照組遷移率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AdGFP+高糖組的遷移率明顯高于AdGFP對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的遷移率明顯低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRPV1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞在高糖刺激下的遷移率影響

2.2 各組細(xì)胞中TRPV1及表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白表達(dá)比較 AdTRPV1對(duì)照組與AdGFP對(duì)照組的TRPV1、α-SMA和OPN表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AdGFP+高糖組的TRPV1、α-SMA表達(dá)低于AdGFP對(duì)照組，OPN表達(dá)高于AdGFP對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的α-SMA表達(dá)高于AdGFP+高糖組，OPN表達(dá)低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blotting檢測(cè)表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白OPN、α-SMA及TRPV1表達(dá)(a.電化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白印跡；b.相對(duì)蛋白含量量化分析)

3 討論

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，與非糖尿病相比，糖尿病患者合并心血管疾病的比例顯著升高。既往研究表明，在高糖刺激下，血管平滑肌細(xì)胞由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型，并導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等病理現(xiàn)象的發(fā)生與發(fā)展[10]。有研究表明，應(yīng)用白細(xì)胞介素-6單克隆抗體Tocilizumab可抑制高糖引起的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，并產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)[11]。另一項(xiàng)國(guó)外研究表明，MiR-381-3p通過靶向HMGB1，抑制了由高糖刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[12]。然而，目前臨床措施干預(yù)由高糖引起的多種血管疾病效果欠佳。因此，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，抑制血管平滑肌細(xì)胞在高糖刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而減少心血管并發(fā)癥至關(guān)重要。

TRPV1在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。有研究表明，TRPV1激活顯著降低自發(fā)性高血壓小鼠來(lái)源的血管平滑肌細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶的活性和蛋白激酶B的磷酸化水平，減輕顱內(nèi)小動(dòng)脈重塑[13]。本研究結(jié)果顯示，AdGFP+高糖組的遷移率明顯高于AdGFP對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的遷移率明顯低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，TRPV1對(duì)由高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移率的增加具有重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果還顯示，AdGFP+高糖組的TRPV1、α-SMA表達(dá)低于AdGFP對(duì)照組，OPN表達(dá)高于AdGFP對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AdTRPV1+高糖組的α-SMA表達(dá)高于AdGFP+高糖組，OPN表達(dá)低于AdGFP+高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，TRPV1可逆轉(zhuǎn)由高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞收縮型蛋白標(biāo)志物水平的下降，同時(shí)抑制血管平滑肌細(xì)胞向分泌表型轉(zhuǎn)換。

綜上所述，血管平滑肌細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下，TRPV1表達(dá)下調(diào)，血管平滑肌細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)化為分泌型，平滑細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，過表達(dá)TRPV1可改善由高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。