曾雪愛 周春權 吳華嵩 黃俊山
(福建省中醫(yī)藥科學院,福州,350003)
睡眠和覺醒是人的一生中反復交替出現(xiàn)的2種生理狀態(tài),但隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快,睡眠與覺醒的平衡常常被破壞,從而引起失眠。長期失眠不僅影響人們的生命質量和身心健康,而且常會加重或誘發(fā)心悸、胸痹、眩暈、頭痛、中風等[1]。目前,傳統(tǒng)鎮(zhèn)靜催眠藥可以改善失眠患者的睡眠,但存在耐受或依賴等不良反應[2],近年來,對于中醫(yī)藥治療失眠開展了廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)許多中草藥具有良好的鎮(zhèn)靜安神作用,而且不良反應小。
松郁安神方為國家重點???神志病)學術帶頭人、第六批全國老中醫(yī)藥專家學術經(jīng)驗繼承工作指導老師、福建省名中醫(yī)黃俊山教授臨床經(jīng)驗方,由甘松、郁金、玫瑰花、酸棗仁、柴胡、珍珠母、生龍骨、合歡皮、丹參組成,是臨床上治療失眠的經(jīng)驗效方[3-4]。本實驗采用動物睡眠生物解析系統(tǒng)24 h連續(xù)記錄大鼠腦電和肌電活動,觀察松郁安神方對PCPA致失眠大鼠睡眠時相(覺醒期、非快速眼動睡眠期、快速眼動睡眠期)的影響,客觀評價松郁安神方改善睡眠的作用。
1.1 動物 清潔級雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,體質量(230±10)g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2017-0005;合格證編號:20170005004461]。動物置于安靜、恒溫恒濕、12 h/12 h明暗光照環(huán)境中飼養(yǎng),可自由飲水和進食。
1.2 試劑與儀器 PCPA(Sigma公司,批號:SHBH7873)、自凝牙托水(上海齒科材料廠,批號:01-09-15)、自凝牙托粉(上海珊瑚化工廠,批號:01-11-15)、注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠,批號:A02126012)、中藥飲片(福建鷺燕藥業(yè)股份有限公司)、動物睡眠生物解析系統(tǒng)(KisseiComtec,日本)、68003腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。
2.1 中藥制備 松郁安神方組成:甘松10 g、郁金15 g、玫瑰花10 g、酸棗仁15 g、柴胡15 g、珍珠母30 g、生龍骨30 g、合歡皮15 g、丹參15 g。藥物經(jīng)煎煮及過濾濃縮至3.4 g/mL備用。
2.2 PCPA失眠模型建立 按照參考文獻[5]的方法,于臨用前按照300 mg/kg用量,將PCPA溶于弱堿性生理鹽水,配制成混懸液,按10 mL/kg體質量腹腔注射,連續(xù)2 d,1次/d。
2.3 動物分組與給藥 將大鼠隨機分為3組:空白對照組、PCPA失眠模型組、松郁安神方組,每組4只。松郁安神方組按17 g/kg體質量灌胃給藥,空白對照組和失眠模型組均給予同等體積蒸餾水灌胃,1次/d,共7 d。
2.4 大鼠頭部電極埋植手術 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,將頭部手術區(qū)剃毛,腦立體定位儀固定。剪開皮膚,分離皮下組織,使顱骨完全暴露。分別于前囟前1.0 mm,旁開1.5 mm和后囟前1.0 mm,旁開1.5 mm鉆孔(鉆通顱骨,但未穿破硬腦膜),將2個與采集EEG電極相連的不銹鋼螺絲固定于顱骨的鉆孔中,在后囟另一側鉆孔(未鉆通顱骨),將一個與參比電極相連的不銹鋼螺絲固定于顱骨的鉆孔中,用牙托粉將3個電極封固于顱骨上。另外兩根采集EMG的電極分別插入兩側頸部斜方肌中。所有的電極都連接到一個微型連接器上,并用牙科水泥固定在頭骨上。縫合創(chuàng)口,術后腹腔注射青霉素鈉,恢復7 d后進行實驗。
2.5 大鼠睡眠時相的記錄和分析 末次灌胃給藥后,將大鼠置于記錄籠中,連接記錄系統(tǒng),進行記錄。記錄時EEG和EMG信號通過大鼠頭部電極,途經(jīng)多通道萬向輪,經(jīng)初步放大后將信號接入到放大器。信號經(jīng)濾波后,進一步放大,輸入到電腦,經(jīng)模數(shù)轉換最終獲得數(shù)字信號。記錄從第1天的19:00點開始,到次日19:00點結束,連續(xù)24 h記錄自由活動大鼠的EEG和EMG。記錄結束后,用SleepSign分析軟件,根據(jù)統(tǒng)一設定的標準掃描記錄的EEG/EMG信號,自動判別出覺醒(W)期、NREM期和REM期。掃描完成后,進行人工檢查,必要時改正。
3.1 注射PCPA對大鼠的睡眠時相的影響 為了檢驗PCPA失眠模型是否成功,采用動物睡眠生物解析系統(tǒng)記錄大鼠EEG/EMG信號。圖1是大鼠睡眠過程中的3個狀態(tài):覺醒期(W)、非快速眼動睡眠期(S)、快速眼動睡眠期(R)。W期以高頻低幅的腦波為主,伴有明顯的肌電活動,S期以低頻寬幅的Delta波為主,EMG活動不明顯,R期以Theta波為主,EMG信號基本沒有。
圖1 大鼠各睡眠時相
大鼠給予PCPA造模后,24 h時間過程NREM、REM睡眠量和覺醒量變化情況見圖2A,大鼠晝夜12 h NREM、REM睡眠總時間和覺醒總時間見圖2B。如圖2A所示,24 h時間過程的變化表明,與正常對照組比較,失眠模型組在夜晚(19:00~次日7:00),NREM睡眠時間在1:00時段差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),REM睡眠時間在24:00時段差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),覺醒時間在24:00、1:00、6:00這3個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);在白天(7:00—19:00),NREM和REM睡眠時間較正常對照組明顯減少,覺醒時間明顯增加,其中NREM睡眠時間在7:00、8:00、11:00、14:00、17:00這5個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),REM睡眠時間在10:00、14:00、17:00這3個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),覺醒時間在7:00、11:00、12:00、14:00、17:00這5個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。如圖2B顯示,在夜晚,與正常對照組比較,失眠模型組12 h NREM睡眠總時間、REM睡眠總時間雖然減少,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);在白天,12 h NREM和REM睡眠總時間較正常對照組均明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05),而覺醒總時間明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
圖2 注射PCPA對大鼠睡眠時相的影響
3.2 松郁安神方對PCPA致失眠大鼠睡眠時相的影響 連續(xù)7 d給予松郁安神方后,如圖3A所示,24 h時間過程的變化表明,與PCPA失眠模型組比較,松郁安神方組在夜晚(19:00~次日7:00),NREM睡眠時間在20:00、1:00、5:00這3個時段差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),REM睡眠時間在22:00、5:00、6:00這3個時段差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),覺醒時間在20:00、22:00、1:00、5:00、6:00這5個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01);在白天(7:00~19:00),松郁安神方組NREM和REM睡眠時間較PCPA失眠模型組明顯增加,覺醒時間明顯減少,其中NREM睡眠時間在7:00、11:00、16:00這3個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),REM睡眠時間在7:00、13:00、14:00、16:00、17:00、18:00這6個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),覺醒時間在7:00、11:00、14:00、16:00、17:00這5個時段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。
圖3 松郁安神方對PCPA致失眠大鼠睡眠時相的影響
圖3B顯示,與失眠模型組比較,在夜晚,松郁安神方組12 h NREM睡眠總時間、REM睡眠總時間增加,其中REM睡眠總時間有統(tǒng)計學意義(P<0.05),覺醒總時間則明顯減少(P<0.05);在白天,12 h NREM、REM睡眠總時間較失眠模型組均明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01),而覺醒總時間明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
松郁安神方以甘松、郁金、玫瑰花為君藥,配伍酸棗仁、柴胡、生龍骨、珍珠母、合歡皮、丹參組方,實驗室前期臨床研究證實松郁安神方治療失眠療效顯著[3-4],動物實驗也證實它可以提高PCPA致失眠大鼠抑制性神經(jīng)遞質的含量[6],本研究旨在通過觀察大鼠EEG/EMG變化,客觀地評價松郁安神方改善睡眠的作用。
PCPA致失眠模型是目前公認的動物模型。其原理是由于PCPA是腦內色氨酸羥化酶的抑制劑,能阻滯腦內5-HT的生物合成,使5-HT的含量顯著下降,從而使動物出現(xiàn)完全性失眠[7]。目前腦電圖仍是評價睡眠效率的金指標。動物睡眠生物解析系統(tǒng)可屏蔽外界信號干擾,實時、高效、穩(wěn)定、自動記錄與分析動物睡眠覺醒狀情況[8],本研究采用此系統(tǒng)24 h連續(xù)記錄EEG/EMG信號,觀察大鼠睡眠過程中3個主要時期:覺醒期、非快速眼動睡眠期、快速眼動睡眠期的實時變化,結果發(fā)現(xiàn)腹腔注射PCPA可以降低白天(7:00~19:00)時段NREM和REM睡眠總時間,增加覺醒時間,與正常對照組有統(tǒng)計學差異,說明失眠模型造模成功,而連續(xù)7 d給予松郁安神方后可以明顯增加白天(7:00~19:00)時段NREM和REM睡眠總時間,降低覺醒時間,與PCPA失眠模型比較有統(tǒng)計學差異,表明松郁安神方具有明顯的鎮(zhèn)靜安神作用,其主要從通過增加白天時段NREM和REM睡眠總時間改善睡眠。