張鴻翰,張 蕊,王 瑤,呂 鴻,吳定宇,彭 芳*
(1.大理大學(xué)藥學(xué)院,云南大理 671000;2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大理 671000;3.昆明市兒童醫(yī)院,昆明 650000;4.西雙版納傣族自治州農(nóng)墾醫(yī)院,云南景洪 666100;5.大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理處,云南大理 671000)
肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第五大最常見(jiàn)的惡性腫瘤,在全球癌癥死亡率中排名第二〔1-2〕,具有高惡性、高復(fù)發(fā)率和易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。近年來(lái),許多研究集中于腫瘤血管生成〔3-5〕,腫瘤血管生成是與腫瘤微環(huán)境有關(guān)的重要生物學(xué)過(guò)程之一〔6〕。HCC是一種典型的血管豐富且惡性程度極高的腫瘤,血管生成在HCC 生長(zhǎng)中所起的作用最為突出〔7〕。現(xiàn)階段研究表明HCC 的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多步驟參與、多因素形成的過(guò)程,HCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移與肝癌血管生成存在極為密切的關(guān)系〔8-11〕。
在腫瘤治療中,多肽具有一定的優(yōu)勢(shì),多肽類(lèi)藥物適應(yīng)癥比小分子化合物廣泛,療效更為顯著,分子認(rèn)知性更為優(yōu)良,代謝毒性相對(duì)較低。另外,多肽類(lèi)藥物的穩(wěn)定性和純度高于蛋白質(zhì)藥物,合成成本也相對(duì)較低,幾乎不存在免疫原性〔12〕。同時(shí)針對(duì)性強(qiáng),研發(fā)目標(biāo)清晰,開(kāi)發(fā)率高等也是多肽類(lèi)藥物表現(xiàn)出的明顯優(yōu)勢(shì)〔13〕。
美洲大蠊入藥始載于《神農(nóng)本草》〔14〕中。本研究團(tuán)隊(duì)自1970 年以來(lái)就對(duì)美洲大蠊進(jìn)行了系列研究,先后研發(fā)了系列源自美洲大蠊的藥物,如用于燒傷、燙傷的康復(fù)新液,治療急、慢性心力衰竭的心脈隆注射液和治療乙型肝炎的肝龍膠囊〔15-18〕。
本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究已明確美洲大蠊多肽的前體物CⅡ-3和脫脂膏的抗HCC作用〔12,19〕,但它們提取率低、成本高,并且口服給藥時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依從性低。為了克服這些不足,本課題組從CⅡ-3中分離并鑒定出13 種肽分子,命名為PAP 系列多肽(PAP1~PAP13)。課題組前期對(duì)PAP-1、PAP-2和PAP-3作為實(shí)驗(yàn)藥物進(jìn)行了研究〔12,19-22〕,發(fā)現(xiàn)美洲大蠊多肽對(duì)HCC微環(huán)境的調(diào)節(jié)可能與下調(diào)氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平有關(guān)。在血管生成方面,美洲大蠊多肽可抑制HepG2細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的增殖與遷移,減少兩種細(xì)胞之間的黏附和HUVEC 的小管形成,下調(diào)VEGF 的表達(dá),其中,多肽PAP-2效果更好〔12,19-22〕。因此,為深化前期的研究,本實(shí)驗(yàn)以美洲大蠊多肽PAP-2為實(shí)驗(yàn)藥物,采用H22肝癌細(xì)胞在Balb∕c 小鼠腋下建立荷瘤移植模型,分析PAP-2 對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)和CD34的影響,比較PAP-2在體內(nèi)與CⅡ-3和脫脂膏抗HCC的優(yōu)劣性,為美洲大蠊多肽的進(jìn)一步應(yīng)用提供更有力的支撐和基礎(chǔ)。
1.1 藥物、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物美洲大蠊多肽PAP-2(PF-20160513-02,純度98.057%)、美洲大蠊提取物CⅡ-3、美洲大蠊脫脂膏均由大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院巫秀美博士和張成桂博士提供。
肝癌H22腹水細(xì)胞株,由大理大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室劉曉波副教授饋贈(zèng)。
SPF 級(jí)Balb∕c 小鼠,體質(zhì)量18~22 g,雌雄各半,購(gòu)于昆明楚商科技有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):43004700028293,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心IVC屏障系統(tǒng)內(nèi)。
1.2 試劑與儀器RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco 公司);青霉素和鏈霉素混合物、0.25%胰蛋白酶-EDTA、二甲基亞砜(北京索萊寶公司);5-氟尿嘧啶(5-FU,國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time qPCR)試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia&Inc 公司);引物由廣州iGene 生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì);免疫組織化學(xué)染色(IHC)的一抗、二抗及試劑盒(美國(guó)ABclonal Biotechnology公司);酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(南京建城生物工程有限公司)。
二級(jí)生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)NUAIRE 公司);MOTIC 倒置顯微鏡(新加坡SPEED FAIR 公司);臺(tái)式低速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);超級(jí)純水機(jī)(格力電器中山制造有限公司);自動(dòng)脫水機(jī)、連續(xù)切片機(jī)(美國(guó)Leica 公司);生物組織包埋機(jī)(中國(guó)孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)。
2.1 美洲大蠊各提取物的制備美洲大蠊脫脂膏的制備:將美洲大蠊全蟲(chóng)干燥后進(jìn)行粉碎,用70%乙醇冷浸提取3次,將所得乙醇液進(jìn)行合并、濃縮、提取獲得浸膏,浸膏到脫脂膏的平均收得率為75.18%。美洲大蠊提取物CⅡ-3 的制備:將美洲大蠊脫脂膏上聚酰胺柱,依次應(yīng)用水及不同比例的含水甲醇洗脫,定量收集,分別濃縮,冷凍干燥后即為所用樣品,提取物占生藥的比率為0.2%。美洲大蠊多肽PAP-2用注射用水配置成濃度為1 g∕L 的母液于4 ℃保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基將藥物稀釋到所需濃度即可。
2.2 H22荷瘤模型小鼠的建立移植原代H22肝癌細(xì)胞于小鼠腹腔并傳代7 d,無(wú)菌抽取第2代小鼠腹水,以0.9%氯化鈉溶液稀釋?zhuān)?.4%臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù),當(dāng)細(xì)胞活力>95%后,取細(xì)胞密度為1×107個(gè)∕mL 的細(xì)胞懸液0.4 mL,于小鼠右腋窩處接種,當(dāng)小鼠腋窩處出現(xiàn)明顯瘤組織時(shí)即造模成功。
2.3 分組與給藥將造模成功的100 只小鼠隨即分為10 組,每組10 只(雌雄各半),分別為模型組(0.9%氯化鈉溶液)、5-FU 組(陽(yáng)性對(duì)照藥物,20 mg∕kg)、PAP-2 低劑量組(50 mg∕kg)、PAP-2 中劑量組(100 mg∕kg)、PAP-2 高劑量組(200 mg∕kg)、PAP-2 和5-FU 聯(lián)用低劑量組(50 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU)、PAP-2 和5-FU 聯(lián)用中劑量組(100 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU)、PAP-2 和5-FU 聯(lián)用高劑量組(200 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU)、CⅡ-3 組(200 mg∕kg CⅡ-3)、脫脂膏組(200 mg∕kg脫脂膏)。每只小鼠稱(chēng)重后給藥,給藥容量為0.1 mL∕10 g。分組當(dāng)天定義為D0 天,并于D0 天開(kāi)始給藥,其中,陽(yáng)性藥5-FU 隔天腹腔注射1 次;0.9%氯化鈉溶液、PAP-2、CⅡ-3 和脫脂膏灌胃給藥,每天給藥1 次,均連續(xù)給藥10 d。在D10 天對(duì)所有小鼠安樂(lè)死處理,取材。
2.4 瘤質(zhì)量及臟器指數(shù)的測(cè)定小鼠末次給藥24 h后,眼內(nèi)眥取血,然后脫頸處死,剝?nèi)×鰤K及臟器(脾、胸腺和肝),按下列公式計(jì)算抑瘤率及臟器指數(shù):抑瘤率(%)=(模型組小鼠平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組小鼠平均瘤質(zhì)量)∕模型組小鼠平均瘤質(zhì)量×100%;臟器指數(shù)=臟器(脾、胸腺和肝)質(zhì)量(mg)∕體質(zhì)量(g)。
2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色10%中性福爾馬林液固定肝組織,進(jìn)行脫水、包埋、切片(厚度4 μm),進(jìn)行HE 染色,染色后于倒置顯微鏡下觀察標(biāo)本病理學(xué)改變。
2.6 ELISA 法檢測(cè)bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34的含量小鼠眼內(nèi)眥取血后,將全血于4 ℃環(huán)境下放置2 h,然后在4 ℃條件下以4 000 r∕min離心15 min,吸取上清,置于-20 ℃保存,備用。采用ELISA 法測(cè)定各組小鼠血清中bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34的含量。
2.7 Real-time qPCR 法檢測(cè)bFGF、TGF-β、MMP-9的mRNA 表達(dá)依照All-in-OneTMFirst-cDNA Synthesis Kit 試劑盒和All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行Real-time qPCR 反應(yīng),各引物序列見(jiàn)表1,將反應(yīng)液加入PCR 管中,設(shè)置的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃、10 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃、10 s,60 ℃、20 s,40個(gè)循環(huán);95 ℃、15 s;60 ℃、60 s;95 ℃、15 s。分析反應(yīng)板數(shù)據(jù),從而獲得每個(gè)樣品反應(yīng)的Ct值,與模型組比較后,取2-ΔΔCt值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
2.8 IHC 法檢測(cè)bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34 的表達(dá)將“2.5”中包埋好的組織切片,置于70 ℃恒溫箱中烤片0.5 h。檢測(cè)時(shí)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫二甲苯,檸檬酸抗原修復(fù),3%過(guò)氧化氫阻斷、滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,5%脫脂奶粉封閉,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗脫后滴加bFGF(1:400)、TGF-β(1:400)、MMP-9(1:50)和CD34(1:300)的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,次日室溫復(fù)溫30 min,棄一抗,PBS沖洗3 次,每次5 min。再加二抗(1:200),室溫孵育30 min,棄二抗,PBS 沖洗3 次,每次3 min。DAB 反應(yīng)染色10 min,蘇木素復(fù)染,干燥,封片。用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量陽(yáng)性表達(dá)的吸光度(A)值。
2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以(±s)表示。組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表1 Real-time qPCR引物序列表
3.1 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠瘤塊質(zhì)量的影響與模型組相比,其余各給藥組均在不同程度上對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤有抑制作用,且PAP-2 各劑量組與PAP-2 和5-FU 聯(lián)用各劑量組對(duì)腫瘤的抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。PAP-2 中、高劑量組與PAP-2 和5-FU 聯(lián)用中、高劑量組對(duì)腫瘤抑制作用均優(yōu)于CⅡ-3組和脫脂膏組(P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠瘤塊質(zhì)量的影響(xˉ± s,n = 10)
3.2 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響與模型組相比,5-FU 組脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)均顯著降低,說(shuō)明5-FU對(duì)小鼠的臟器有一定損傷作用。與5-FU 組相比,其余各給藥組胸腺指數(shù)(PAP-2和5-FU聯(lián)用高劑量組及CⅡ-3組除外)、脾臟指數(shù)和肝臟指數(shù)都高于5-FU 組(P<0.05),提示PAP-2對(duì)免疫器官有一定保護(hù)作用。見(jiàn)表3。
表3 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響(xˉ± s,n = 10)
3.3 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響經(jīng)HE 染色后鏡下觀察,可見(jiàn)瘤組織呈現(xiàn)巢狀或片狀生長(zhǎng),腫瘤細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞大小不一、形態(tài)各異,異形明顯,核大深染,易見(jiàn)核分裂相、并見(jiàn)病理性核分裂。模型組染色較深,壞死面積較小。與模型組相比,其余各組染色相對(duì)較淺,呈現(xiàn)不同程度的壞死,腫瘤組織壞死面積相對(duì)較大。提示經(jīng)美洲大蠊多肽PAP-2 及美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脫脂膏處理后,腫瘤組織的惡性程度減輕,腫瘤組織的侵襲能力減弱。見(jiàn)圖1。
圖1 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響(倒置顯微鏡,×100)
3.4 ELISA 檢測(cè)美洲大蠊多肽PAP-2 對(duì)H22荷瘤小鼠血清 中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 的影 響與模型組相比,其余各組小鼠血清中bFGF 含量明顯減少,說(shuō)明PAP-2 能夠降低血清中bFGF 含量;CⅡ-3 組和脫脂膏組在一定程度上下調(diào)了血清中CD34 的含量;PAP-2 中劑量組降低了血清中MMP-9的含量;5-FU組、PAP-2高劑量組、CⅡ-3組和脫脂膏組在一定程度上下調(diào)了小鼠血清中TGF-β的含量(P<0.05)。與5-FU組相比,PAP-2中、高劑量組下調(diào)血清中CD34作用不如5-FU組(P<0.05),其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,血清中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β含量相差不大。見(jiàn)表4。
3.5 IHC 分析美洲大蠊多肽PAP-2 對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的影響
3.5.1 美洲大蠊多肽PAP-2 對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF 蛋白的影響 IHC 結(jié)果見(jiàn)圖2,棕色的細(xì)胞為陽(yáng)性,即bFGF 蛋白表達(dá),顏色的深淺與蛋白表達(dá)量多少成正比。從圖2 可觀察到,模型組染色較深,bFGF 蛋白表達(dá)較多,與模型組相比,其余各給藥組棕色有不同程度變淺,說(shuō)明bFGF 蛋白表達(dá)有不同程度的下降。
表4 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠血清中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β的影響(xˉ±s,n=10,ng∕mL)
圖2 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF蛋白表達(dá)的影響(倒置顯微鏡,×400)
經(jīng)分析數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,與模型組相比,陽(yáng)性藥5-FU 處理后,腫瘤組織中bFGF 平均光密度值降低顯著,說(shuō)明5-FU能下調(diào)腫瘤組織中bFGF表達(dá),其余各給藥組(除PAP-2低劑量組、CⅡ-3組和脫脂膏組外)中bFGF 表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的下降,且5-FU組作用優(yōu)于PAP-2 各劑量組、CⅡ-3 組和脫脂膏組,PAP-2 中、高劑量組下調(diào)腫瘤組織中bFGF 蛋白表達(dá)的作用優(yōu)于CⅡ-3 組和脫脂膏組,PAP-2和5-FU 聯(lián)用低劑量組對(duì)腫瘤組織中bFGF 蛋白的下調(diào)作用優(yōu)于PAP-2低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表5。
表5 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(平均光密度,xˉ± s,n = 10)
3.5.2 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中CD34蛋白的影響 IHC結(jié)果見(jiàn)圖3,棕色的細(xì)胞為陽(yáng)性,即CD34蛋白表達(dá),顏色的深淺代表蛋白表達(dá)量的多少。從圖3可觀察到,模型組染色較深,CD34蛋白表達(dá)較多,與模型組相比,其余各給藥組棕色有不同程度變淺,說(shuō)明CD34蛋白表達(dá)有不同程度的下降。
由表5 可知,與模型組相比,陽(yáng)性藥5-FU 作用后,腫瘤組織中CD34 光密度值降低明顯,說(shuō)明5-FU 能明顯下調(diào)腫瘤組織中CD34 表達(dá),其余各給藥組中CD34 表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的下降,且5-FU組對(duì)腫瘤組織中CD34 的下調(diào)作用優(yōu)于PAP-2 各劑量組、CⅡ-3 組和脫脂膏組,PAP-2 中、高劑量組降低腫瘤組織中CD34 蛋白作用優(yōu)于CⅡ-3 組和脫脂膏組(P<0.05)。
3.5.3 美洲大蠊多肽PAP-2 對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中MMP-9 蛋白的影響 IHC 結(jié)果見(jiàn)圖4,染為棕色的細(xì)胞為陽(yáng)性,即MMP-9 蛋白表達(dá),顏色的深淺代表蛋白表達(dá)量的多少。從圖4 可以觀察到,模型組染色細(xì)胞較多、染色較深,表明MMP-9 蛋白表達(dá)較多,與模型組相比,其余各給藥組棕色有不同程度變淺,說(shuō)明MMP-9 蛋白表達(dá)有不同程度的下降。
圖4 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中MMP-9蛋白的影響(倒置顯微鏡,×400)
從表5 可知,與模型組相比,陽(yáng)性藥5-FU 處理后,腫瘤組織中MMP-9 光密度值降低明顯,說(shuō)明5-FU 能下調(diào)腫瘤組織中MMP-9 蛋白表達(dá),其余各給藥組中MMP-9 表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的下降,提示美洲大蠊多肽PAP-2 和美洲大蠊提取物CII-3 和脫脂膏能夠下調(diào)腫瘤組織中MMP-9 蛋白的表達(dá),且5-FU 作用優(yōu)于CII-3 和脫脂膏,PAP-2 作用優(yōu)于CⅡ-3和脫脂膏(P<0.05)。
3.5.4 美洲大蠊多肽PAP-2 對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中TGF-β蛋白的影響 IHC 結(jié)果見(jiàn)圖5,棕色的細(xì)胞表示陽(yáng)性,即代表TGF-β蛋白的表達(dá),顏色的深淺代表蛋白表達(dá)量的多少。從圖5 可以觀察到,模型組棕色細(xì)胞較多、棕色較深,說(shuō)明TGF-β蛋白表達(dá)相對(duì)較多,與模型組相比,其余各給藥組棕色有不同程度變淺,顯示TGF-β蛋白表達(dá)有不同程度的下降。
從表5 可知,與模型組相比,陽(yáng)性藥5-FU 處理后,腫瘤組織中TGF-β光密度值降低顯著,說(shuō)明5-FU 能明顯下調(diào)腫瘤組織中TGF-β蛋白表達(dá),其余各給藥組中TGF-β表達(dá)均呈現(xiàn)不同程度的下降,PAP-2 下調(diào)腫瘤組織中TGF-β蛋白表達(dá)作用優(yōu)于CⅡ-3和脫脂膏,PAP-2和5-FU聯(lián)用中劑量組下調(diào)腫瘤組織中TGF-β蛋白表達(dá)作用優(yōu)于PAP-2 中劑量組(P<0.05)。
圖5 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中TGF-β蛋白的影響(倒置顯微鏡,×400)
3.6 Real-time qPCR 測(cè)定美洲大蠊多肽PAP-2 對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF mRNA、MMP-9 mRNA和TGF-β mRNA 的影響與模型組相比,5-FU 組,PAP-2 中、高劑量組,PAP-2 和5-FU 聯(lián)用中、高劑量組均對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF mRNA 呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中5-FU組上調(diào)作用最明顯,而CⅡ-3 組荷瘤小鼠腫瘤組織的bFGF mRNA 的表達(dá)有所下調(diào)(P<0.05)。與模型組比較,5-FU 組,PAP-2低、中劑量組,PAP-2和5-FU聯(lián)用低、中劑量組,CII-3 組和脫脂膏組都能從不同程度上調(diào)荷瘤小鼠腫瘤組織中MMP-9 mRNA 的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),PAP-2 對(duì)MMP-9 mRNA 表達(dá)的上調(diào)作用與PAP-2 的劑量呈負(fù)相關(guān)。與模型組相比,PAP-2低、中劑量組,PAP-2和5-FU聯(lián)用高劑量組都能上調(diào)荷瘤小鼠腫瘤組織中TGFβmRNA 的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中PAP-2 低劑量組的上調(diào)作用相對(duì)較優(yōu),而PAP-2高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織中TGF-βmRNA 的表達(dá)有所下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表6。
表6 美洲大蠊多肽PAP-2對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF mRNA、MMP-9 mRNA和TGF-β mRNA的影響(xˉ± s,n = 10)
HCC 微環(huán)境是由細(xì)胞成分、肝癌細(xì)胞、其余多類(lèi)除肝細(xì)胞外互相作用的細(xì)胞和非細(xì)胞成分細(xì)胞外基質(zhì)組成的復(fù)雜的肝癌產(chǎn)生、發(fā)展和遷移的內(nèi)環(huán)境〔23〕。在正常的生理?xiàng)l件下,肝癌微環(huán)境由于組織和器官的自我穩(wěn)定性而處于動(dòng)態(tài)平衡。然而,在癌癥的早期,各種腫瘤促進(jìn)因子在打破肝癌微環(huán)境的原始平衡中起作用,導(dǎo)致微環(huán)境向肝癌的有利方向發(fā)展。
本研究發(fā)現(xiàn)PAP-2 對(duì)腫瘤有抑制作用,而且抗腫瘤作用是劑量依賴(lài)性的,劑量越高,抗腫瘤效果越好,且效果優(yōu)于CⅡ-3 和脫脂膏(P<0.05)。PAP-2 對(duì)器官損傷有一定的保護(hù)作用。 ELISA 結(jié)果表明,PAP-2 只能下調(diào)H22荷瘤小鼠血清中bFGF的含量。荷瘤小鼠血清中bFGF、CD34 和TGF-β的含量在PAP-2、CⅡ-3 和脫脂膏的作用下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IHC 結(jié)果表明,PAP-2 可以降低H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的表達(dá)。此外,PAP-2 在抑制小鼠腫瘤組織中CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的表達(dá)方面較優(yōu)。ELISA 和IHC 共同表明,PAP-2 在抑制腫瘤組織中的bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β的表達(dá)以及肝癌的血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用優(yōu)于CⅡ-3 和脫脂膏。
Real-time qPCR 結(jié)果顯示,PAP-2 可以上調(diào)H22荷瘤小鼠腫瘤組織中bFGF、MMP-9 和TGF-β的mRNA 表達(dá)。qPCR 實(shí)驗(yàn)的某些結(jié)果與IHC 的結(jié)果相反。該結(jié)果的可能性如下:動(dòng)物體內(nèi),藥物的代謝是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,再加上諸如肝癌等可變的腫瘤環(huán)境,其中的過(guò)程和最終結(jié)果是不可預(yù)測(cè)的。 PAP-2 是從CⅡ-3 中提取的一種多肽單體,尚不清楚其對(duì)肝癌的特異性作用位點(diǎn)和作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)測(cè)量的這些指標(biāo)在肝癌的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中會(huì)相互影響,并且某些指標(biāo)同時(shí)處于肝癌的早期和晚期。有相反的效果,具體原因仍不清楚。
總之,從該實(shí)驗(yàn)中可以看出,PAP-2 可以抑制荷瘤小鼠H22的腫瘤生長(zhǎng),這可能與bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。這些因子與肝癌的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),因此PAP-2 的作用機(jī)制可能是抑制肝癌的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。
綜上所述,美洲大蠊多肽PAP-2 對(duì)肝癌的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響優(yōu)于CⅡ-3和脫脂膏,表明PAP-2具有繼續(xù)研究的意義和價(jià)值。對(duì)于PAP-2上調(diào)腫瘤組織中bFGF、MMP-9 和TGF-βmRNA 表達(dá)的結(jié)果,可為下一步該組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供參考和啟示,具體原因有待進(jìn)一步研究和探索。同時(shí),這也表明影響肝癌血管生成的因素并不十分局限,無(wú)法在本研究中提及,正在等待更多的研究人員發(fā)現(xiàn)和探索。