王永寬，田新雁，蘇 娟，龐 博，周 萍*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

肝缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是肝臟缺血一段時間后再恢復(fù)血流灌注，再灌注不但沒有使肝臟結(jié)構(gòu)、功能恢復(fù)，反而使損傷程度加重的現(xiàn)象〔1〕。HIRI 是肝移植、休克復(fù)蘇、嚴重肝外傷及肝葉切除等過程中不可避免的，嚴重時可導(dǎo)致肝功能衰竭，甚至死亡，是肝移植術(shù)后肝功能衰竭的主要原因〔2〕。目前，已有大量關(guān)于HIRI發(fā)生機制的研究，其中認為自由基氧化應(yīng)激損傷是其重要的機制之一〔3〕，需要有效的方法來預(yù)防或減輕這種肝損傷。

分心木（Diaphragma juglandisFructus）是胡桃科胡桃屬核桃（Juglans regiaL.）果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜，含有大量的生物活性物質(zhì)，如酚酸類、黃酮類、萜類、多糖類等，具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗炎、抗微生物、抗誘變、免疫調(diào)節(jié)和保護心血管等功能，被廣泛用于治療腹瀉、腎虛、失眠遺精、血尿、保肝和子宮出血等〔4-7〕。分心木提取物的體外研究已發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯部位酚酸類成分具有較好的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基及超氧陰離子清除能力，并能有效抑制黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)其在大鼠125 mg∕（kg·d）的灌胃劑量下，具有較好的抗氧化活性，且無明顯毒副作用〔8-9〕。

分心木作為核桃加工過程中的副產(chǎn)物，資源豐富，但目前主要用作燃料或直接丟棄，浪費資源。本研究用分心木乙酸乙酯部位提取物預(yù)處理大鼠HIRI 模型，以觀察其對HIRI 的保護作用及機制，為深入研究開發(fā)利用分心木的藥用價值提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料分心木乙酸乙酯部位提取物實驗室自制；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、一氧化氮（NO）測試盒、XOD 測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒購自天根生化科技有限公司；同型半胱氨酸（Hcy）測定試劑盒購自上海泛柯實業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器JR-30鼠恒溫實驗臺（成都泰盟軟件有限公司）；TGL-18R冷凍離心機（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；Haier 超低溫保存箱（海爾股份有限公司）；VCX130超聲細胞粉碎儀（美國SONICS&MATERIALS公司）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；GL-88B 旋渦混合器（海門其林貝爾儀器有限公司）；T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；BioTek Synergy HT多功能酶標儀（基因有限公司）；OLYMPUS BX53 熒光顯微鏡（上海土森視覺科技有限公司）。

2 方法

2.1 實驗動物分組與給藥30 只同一批次的SPF級SD 雄性大鼠，體質(zhì)量為（200±20）g，購自于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（滇）2015-0002，隨機編號分為空白組（S組）、缺血-再灌注組（I∕R 組）和給藥組（DJ 組）3 組，每組10 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，DJ 組灌胃分心木乙酸乙酯部位提取物125 mg∕（kg·d）〔9〕，S組和I∕R 組灌胃給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥14 d后造模。

2.2 HIRI模型建立造模前12 h內(nèi)禁食不禁水。用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（0.6 mL∕100 g），并將其固定于鼠臺上，控制體溫（37±0.5）℃，下腹正中切口，暴露出肝門三靜脈。根據(jù)劉俊平等〔10〕的方法，I∕R 組和DJ 組采用無創(chuàng)血管夾夾閉左外側(cè)葉和中葉的肝動脈、門靜脈，阻斷入肝約70% 血流90 min，S 組僅行肝蒂騷擾，90 min 后縫合腹部切口兩層。繼續(xù)飼養(yǎng)24 h后取材，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肝組織病理學(xué)變化取一部分左外肝葉組織，4%多聚甲醛固定，蘇木精-伊紅（HE）染色法制備4 μm厚切片，鏡下觀察肝組織病理損傷變化。

2.4 肝功能指標測定按照試劑盒說明書步驟，取肝組織勻漿上清液，先采用BCA 法測定蛋白濃度，再用紫外可見分光光度計測組織勻漿中AST和ALT的OD值并計算活力。

2.5 肝組織生化指標檢測根據(jù)試劑盒說明書依次測定肝組織中MDA、SOD、XOD、NO、GSH-Px 和Hcy的OD值并計算相應(yīng)酶活力及含量。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，計量資料以（xˉ±s）來表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠HIRI 建模情況通過HIRI 建模，可見肝顏色由鮮紅變?yōu)榘导t，再恢復(fù)供血24 h，其間顏色恢復(fù)即初步判定造模成功。見圖1。

圖1 大鼠肝臟缺血前、后情況

3.2 肝組織病理變化HE染色結(jié)果顯示，S組肝臟肝細胞形態(tài)正常，排列整齊，中央靜脈清晰完整。見圖2A。I∕R 組肝竇受擠壓消失，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞水腫，變性，且出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤。見圖2B。DJ組肝組織病理形態(tài)較I∕R組均有不同程度的改善，肝細胞水腫、變性、壞死和炎性細胞浸潤減輕，說明大鼠在分心木的預(yù)處理下，能減輕HIRI。見圖2C。

圖2 大鼠肝組織病理變化（HE染色，×200）

3.3 大鼠肝功能的變化AST 和ALT 活力是反映肝組織損傷程度的重要標志。與S組相比，I∕R 組大鼠肝組織中AST 和ALT 酶活力均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而與I∕R 組相比，DJ組大鼠肝組織中AST 和ALT 酶活力均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠肝組織中AST和ALT的活力變化（xˉ± s，U∕gprot）

3.4 大鼠肝臟氧化指標的變化與S 組相比，I∕R組大鼠肝組織中XOD 的活力明顯升高，SOD 和GSH-Px 的活力明顯降低，MDA 和NO 含量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。而與I∕R組相比，DJ 組大鼠肝組織中XOD 的活力明顯降低，SOD 和GSH-Px 的活力均升高，MDA 和NO 含量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

3.5 大鼠肝臟中Hcy 含量的變化與S 組相比，I∕R組大鼠肝組織中Hcy 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而與I∕R 組相比，DJ 組大鼠肝組織中Hcy含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 大鼠肝組織中XOD、SOD、GSH-Px活力及MDA、NO、Hcy含量的變化（xˉ± s）

4 討論

HIRI是一個多因素參與的復(fù)雜病理生理過程，其中氧化應(yīng)激作為參與HIRI的一個重要途徑，主要通過活性氧（ROS）的大量產(chǎn)生參與HIRI 發(fā)生的過程，在HIRI 中起到關(guān)鍵作用。當(dāng)發(fā)生HIRI 時活化的Kupffer 細胞和肝細胞以及內(nèi)皮竇細胞氧化呼吸鏈減少，產(chǎn)生大量ROS 如超氧陰離子和過氧化氫（H2O2）等〔11-12〕。當(dāng)機體無法清除體內(nèi)多余ROS 時，生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細胞結(jié)構(gòu)改變并導(dǎo)致其功能代謝障礙等，其代謝產(chǎn)物如MDA等可破壞膜的完整性，使膜脆性增加，細胞內(nèi)外物質(zhì)交換發(fā)生障礙，影響膜的正常功能，導(dǎo)致細胞及組織廣泛性損傷〔13〕。

細胞內(nèi)XOD 是HIRI 時形成ROS 的重要來源。肝臟缺血時，胞內(nèi)ATP 代謝為次黃嘌呤在缺血肝組織中大量堆積，隨著供氧中斷，引起ATP 耗竭，Na+-K+-ATP泵功能失調(diào)，Na+聚集胞內(nèi)激活Na+∕Ca2+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，導(dǎo)致Ca2+進入胞內(nèi)增多，促使大量的黃嘌呤脫氫酶快速轉(zhuǎn)化為XOD。當(dāng)血流再灌注時，大量的O2分子隨血流進入缺血組織與XOD 催化，使次黃嘌呤代謝為黃嘌呤的氧化反應(yīng)加速，進而使再灌注組織內(nèi)ROS 迅速增加，超出機體的清除能力從而加重組織損傷〔14〕。

Hcy是一種具有細胞毒性的含硫氨基酸，是心腦血管疾病的獨立危險因子，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔15〕。當(dāng)肝臟功能不全或受損時，會導(dǎo)致機體糖類、脂質(zhì)類及氨基酸等代謝障礙，其中Hcy代謝也將會受阻〔16〕。隨著Hcy 水平的不斷升高，心腦血管疾病的危險度也隨之增加。Hcy的巰基在重金屬離子（如Fe3+或Cu2+）的催化下易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，生成超氧化物、H2O2及羥自由基等活性氧損傷細胞。Hcy巰基的自身氧化，會促進ROS生成，ROS與NO發(fā)生反應(yīng)，并使其失活；Hcy 還會干擾谷胱甘肽（GSH）合成，抑制GSH與NO相互作用導(dǎo)致血管損傷等〔17〕。

分心木富含多種類型活性成分，這些活性成分按照極性大小分布于不同部位，在功能上主要體現(xiàn)在抗氧化以及抗菌、抗炎方面。研究〔18〕表明，通過對分心木中單體化合物進行體外抗氧化性能分析，發(fā)現(xiàn)沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、咖啡酸等酚酸類成分均具有較好的抗氧化活性，并且研究發(fā)現(xiàn)總酚酸含量較高的乙酸乙酯部位具有明顯的體內(nèi)抗氧化效果〔9〕，這為分心木治療由氧化應(yīng)激引起的疾病提供了理論依據(jù)。

HIRI 的藥物預(yù)處理是利用藥物中某些生物活性物質(zhì)直接或間接的藥理作用來增強細胞或組織對該損傷的耐受性，從而使損傷程度減輕的一種有效防治方法。本研究通過用分心木乙酸乙酯提取物預(yù)處理HIRI 大鼠來檢測其肝功能指標、氧化指標、Hcy水平及觀察組織病理切片，探討分心木提取物對肝缺血再灌注損傷的抗氧化作用。結(jié)果顯示，與I∕R 組比較，DJ 組大鼠在用分心木提取物預(yù)處理后，AST 和ALT 的活力明顯降低，肝組織病理結(jié)構(gòu)損傷均有不同程度改善。說明肝臟缺血-再灌注前給予分心木提取物預(yù)處理能改善肝臟的功能，減輕肝細胞的損傷，具有保護肝臟的作用。DJ組大鼠肝組織SOD 和GSH-Px 活力明顯升高，MDA 和NO 含量降低，XOD 活力和Hcy 含量顯著降低，說明分心木提取物預(yù)處理能減輕肝細胞生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少黃嘌呤氧化途徑產(chǎn)生的自由基，減輕Hcy的自身氧化作用，提高抗氧化能力，減輕HIRI。