劉向芳，王 璐，陳 潔，孫 輝，陸紹玉，劉 幸

（昆明市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650041）

肺結(jié)核是臨床常見(jiàn)疾病，也是發(fā)病率最高的結(jié)核病，屬于一種慢性傳染性疾病。目前常見(jiàn)的肺結(jié)核治療方法是應(yīng)用抗結(jié)核藥物如異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺，雖然在治療中發(fā)揮良好的藥效，但長(zhǎng)期使用這些藥物，毒副作用不可避免，易產(chǎn)生耐藥性，給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔1〕。肺結(jié)核在中醫(yī)上屬于“肺癆”范疇〔2〕，尋找新的抗癆藥物是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。治療肺結(jié)核的機(jī)制主要是抑制和殺滅結(jié)核分枝桿菌。

貓爪草為毛莨科植物小毛莨（Ranunculus ternatusThunb.）的干燥塊根，具有抗菌消炎、消腫解毒、化痰散結(jié)等功效，臨床上常用于治療偏頭痛、牙痛、咽喉腫痛、肺結(jié)核等疾病，現(xiàn)代研究表明貓爪草具有抗腫瘤、抑菌、保肝、抗氧化等作用，并對(duì)耐藥肺結(jié)核患者有較好的療效〔3-5〕，具有較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)外抗結(jié)核作用，對(duì)結(jié)核桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用。貓爪草是昆明市第三人民醫(yī)院自擬“抗癆補(bǔ)肺湯”的主要成分，抗癆補(bǔ)肺湯主要通過(guò)滋陰補(bǔ)肺、抗菌殺菌，優(yōu)化了血液流變學(xué)，抑制細(xì)菌的繁殖生長(zhǎng)，提高了肺部的抗菌能力〔6-7〕。雖然已有部分研究表明，貓爪草具有多系統(tǒng)的藥理作用，但是單味中藥具有較多的活性成分和多靶點(diǎn)的功效，且中藥的活性成分間具有協(xié)同作用的特點(diǎn)，因此，從單一的系統(tǒng)作用去闡述貓爪草的藥理作用，闡述并不全面。

目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)新興的學(xué)科領(lǐng)域，主要建立在藥理學(xué)的基礎(chǔ)上，基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，可以反映化合物與靶點(diǎn)之間的復(fù)雜相互作用，從而更直觀理解中藥和機(jī)體間的相互作用，提高藥物的治療效果，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)貓爪草治療肺結(jié)核機(jī)制進(jìn)行研究，更科學(xué)地闡述貓爪草的現(xiàn)代藥理作用機(jī)制，為更有針對(duì)性地深入探索貓爪草的藥理作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）；UniProt 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：∕∕www.uniprot.org∕）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∕∕www.genecards.org）；STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：∕∕string-db.org∕）；Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∕∕www.bioconductor.org∕）；Perl軟件（https：∕∕www.perl.org∕）；R 軟件（https：∕∕www.r-project.org∕）；Cytoscape 3.6.1軟件（http：∕∕www.cytoscape.org∕）。

1.2 貓爪草活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)將“貓爪草”輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索框中，限定詞為“Herb name”，搜索貓爪草所含活性成分，依據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)官網(wǎng)推薦，以口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件。同時(shí)通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)的成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型，獲得貓爪草的靶點(diǎn)，利用Perl軟件在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取活性成分對(duì)應(yīng)的靶基因，限定物種為“Homo Sapiens”。

1.3 肺結(jié)核靶點(diǎn)篩選通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索肺結(jié)核疾病相關(guān)基因，在搜索框中以“tuberculosis”為關(guān)鍵詞，進(jìn)行搜索，獲得已經(jīng)報(bào)道的肺結(jié)核相關(guān)基因（即疾病靶點(diǎn)），去除假陽(yáng)性基因，與貓爪草的活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配生成韋恩圖，從而獲得共同靶點(diǎn)。

1.4 貓爪草“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建根據(jù)貓爪草的活性成分及預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)，建立“活性成分-作用靶點(diǎn)”的相互對(duì)應(yīng)關(guān)系。將活性成分與靶點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（node），制成后綴為txt 的文本文檔，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件中，構(gòu)建貓爪草“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將共同靶點(diǎn)基因傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，其物種為“Homo Sapiens”，去除離散的點(diǎn)，構(gòu)建貓爪草的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析將交集基因傳至Bioconductor 數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用R 軟件進(jìn)行基因本體的GO 功能和KEGG 通路富集分析。此過(guò)程中，限定物種為“Homo Sapiens”，以P值反應(yīng)生物功能的顯著性及通路的富集程度，P＜0.05 表示該富集結(jié)果具有顯著性；P值越小，其顯著性越高。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選結(jié)果通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到貓爪草化學(xué)成分79 個(gè)，496個(gè)靶點(diǎn)。以O(shè)B ≥30%和DL ≥0.18為篩選條件，從而獲得化學(xué)成分12 個(gè)，見(jiàn)表1。首先利用Perl 軟件提取12 個(gè)化學(xué)成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，再在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中找出化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶基因名稱，物種限定為“Homo Sapiens”，去除重復(fù)的基因，共獲得40 個(gè) 靶點(diǎn)基因，分別為ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A、ADRB1、ADRB2、AKR1B1、BAX、BCL2、CASP3、CASP8、CASP9、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRNA2、CTRB1、GABRA1、JUN、KCNH2、LTA4H、MAOA、MAOB、MAP2、NCOA1、NCOA2、NR3C2、OPRM1、PGR、PLAU、PON1、PRKCA、PTGS1、PTGS2、RXRA、SCN5A、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4。

2.2 肺結(jié)核靶點(diǎn)篩選結(jié)果通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，去除假陽(yáng)性基因，共獲得2 316 個(gè)疾病基因。根據(jù)上述“2.1”所獲得貓爪草活性成分靶點(diǎn)基因40 個(gè)和疾病肺結(jié)核靶點(diǎn)基因2 316 個(gè)，通過(guò)繪制韋恩圖獲得共同靶點(diǎn)基因14 個(gè)，分別為ADRB2、PTGS2、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、PLAU、LTA4H、MAOA。見(jiàn)圖1。

表1 貓爪草活性成分篩選結(jié)果

圖1 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 貓爪草“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將貓爪草的活性成分及作用靶點(diǎn)輸入軟件Cytoscape 3.6.1，構(gòu)建“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖2。其中三角形圖標(biāo)為活性成分，橢圓形圖標(biāo)為作用靶點(diǎn)，菱形圖標(biāo)為疾病，六邊形圖標(biāo)為藥物。

圖2 貓爪草“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將“2.2”所獲得的14 個(gè)共同靶點(diǎn)基因傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI分析，去除孤立點(diǎn)，該網(wǎng)絡(luò)包括14 個(gè)節(jié)點(diǎn)、27 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為3.86，其中節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)系評(píng)分前20位見(jiàn)表2。

表2 節(jié)點(diǎn)間相互關(guān)系的評(píng)分

2.5 GO 功能分析將“2.2”共同靶點(diǎn)基因傳至Bioconductor數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用R軟件對(duì)貓爪草靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析，閾值設(shè)置P＜0.05，共得到GO 條目14個(gè)，主要包括生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分，結(jié)果見(jiàn)表3，并將其可視化展示，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.6 KEGG 信號(hào)通路分析KEGG 富集分析，閾值設(shè)置P＜0.05，得到20 條信號(hào)通路，以P值大小為條件進(jìn)行篩選，并將其可視化展示，結(jié)果見(jiàn)圖4，前10條信號(hào)通路及其涉及的基因見(jiàn)表4。貓爪草治療肺結(jié)核的機(jī)制包括細(xì)胞凋亡、p53 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路。其中與肺結(jié)核相關(guān)的通路為細(xì)胞凋亡、p53 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路，對(duì)應(yīng)基因?yàn)锽CL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、JUN。

3 討論

貓爪草1977年開(kāi)始收載于《中華人民共和國(guó)藥典》〔8〕，屬于毛茛科植物小毛茛的干燥塊根，該藥為一種非常用草藥，性溫、味甘辛，具有消腫散結(jié)、清熱解毒的功效，現(xiàn)今逐步發(fā)現(xiàn)貓爪草用于治療腫瘤、淋巴結(jié)核和肺結(jié)核等疾病，療效顯著，特別是對(duì)耐藥肺結(jié)核患者具有較好療效〔5-7〕。近年來(lái)有研究表明貓爪草具有抗腫瘤、抗結(jié)核、免疫調(diào)節(jié)功能、抗氧化等多種活性，是因?yàn)樨堊Σ莼钚猿煞种性碥疹惥哂锌鼓[瘤作用，甾醇類具有抗結(jié)核、抑菌作用，其抑菌作用較異煙肼稍強(qiáng)，多糖類具有抗氧化、減輕和修復(fù)肝損傷及保肝作用、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能〔6-9〕。

本研究通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到貓爪草活性成分12 個(gè)，其中有對(duì)應(yīng)作用靶點(diǎn)的活性成分為5個(gè)。由貓爪草“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖可見(jiàn)，上述5 個(gè)活性成分作用于14 個(gè)靶點(diǎn)，體現(xiàn)了中藥治療疾病多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。有研究已證實(shí)，貓爪草作為一種新的抗結(jié)核藥，不僅能有效地抑制結(jié)核分枝桿菌，還可增強(qiáng)患者的機(jī)體免疫力，改善患者肺部血液循環(huán)和病灶周?chē)臓I(yíng)養(yǎng)，對(duì)耐藥菌株有一定療效，并可以抑制持留結(jié)核菌，從而更有效地治療肺結(jié)核〔10〕。有研究發(fā)現(xiàn)，貓爪草中的多糖、皂苷成分可使吞噬百分率、吞噬指數(shù)顯著升高，還可顯著促進(jìn)溶血素的形成并提高外周血中T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，可能通過(guò)減少結(jié)核分枝桿菌HspX 蛋白表達(dá)水平，影響結(jié)核菌的正常代謝發(fā)揮抑菌作用〔11〕。貓爪草“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)度最高的是β-谷甾醇，其次是豆甾醇，貓爪草的醇提取物可增強(qiáng)耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）感染小鼠的細(xì)胞免疫功能，通過(guò)促進(jìn)GLS mRNA 的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）殺菌能力，從而達(dá)到抗結(jié)核休眠菌的作用，醇提取物中的吡咯丁酸4-［formyl-5-（hydroxymethyl）-1H-pyrrol-1-yl］butanoicacid 對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv）、耐多藥菌株（MDR）、廣泛耐藥株（XDR）均具有較強(qiáng)的抑制作用〔9〕，而其余三種活性成分與肺結(jié)核相關(guān)性的報(bào)道不多，可作為學(xué)者后續(xù)研究的重點(diǎn)之一。貓爪草“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中排名前5 位的靶蛋白分別為CASP3、ADRB2、CASP8、CASP9、PTGS2。陳柯宇等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，CASP3 可抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其凋亡的分子機(jī)制。有研究表明，ADRB2這個(gè)基因的變化與支氣管及血管反應(yīng)都有一定的相關(guān)性，可能在某種程度上影響疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程〔13〕。CASP8 是死亡受體凋亡通路的重要起始型蛋白酶。馬明等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)CASP9 廣泛表達(dá)于人類的正常組織，如神經(jīng)組織、肝臟、胃和肺等，且參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。PTGS2 能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞遷移、黏附及抑制血管生成，在炎癥、各種癌癥的治療中發(fā)揮著很大的作用。鑒于上述靶蛋白在機(jī)體炎癥、腫瘤、肺功能等方面產(chǎn)生作用，筆者認(rèn)為其可能成為貓爪草治療肺結(jié)核的相關(guān)靶點(diǎn)。

表3 GO功能分析結(jié)果

圖3 GO功能分析圖

圖4 KEGG信號(hào)通路富集分析圖

表4 KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果

從韋恩圖可知，貓爪草與肺結(jié)核的交集基因共14 個(gè)，提示貓爪草對(duì)肺結(jié)核的治療具有多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含14 個(gè)節(jié)點(diǎn)、27 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為3.86，說(shuō)明這些交集基因的編碼蛋白之間相互作用緊密。

GO 分析結(jié)果顯示，疾病的靶點(diǎn)主要是針對(duì)生物過(guò)程，涉及半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過(guò)程、死亡受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等，提示這些生物過(guò)程在治療疾病中起到了關(guān)鍵作用。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，貓爪草與肺結(jié)核最相關(guān)的通路包括細(xì)胞凋亡、p53信號(hào)通路等。其中細(xì)胞凋亡通路涉及的靶點(diǎn)基因?yàn)锽CL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8；p53信號(hào)通路涉及的靶點(diǎn)基因?yàn)锽CL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8。有研究表明，BCL2基因表達(dá)可抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖及侵襲，促進(jìn)其凋亡〔13〕；BAX 抑制傳遞線粒體的抗凋亡信號(hào)，在鼠急性腎損傷（AKI）模型中能夠減輕腎衰竭、炎癥和腎小管死亡〔14〕；在順鉑處理后，CASP9 與細(xì)胞凋亡和抗性有關(guān)〔15〕；CASP8 是細(xì)胞凋亡的外在途徑所必需的蛋白酶，在細(xì)胞死亡中起著雙重作用，其中在腫瘤細(xì)胞死亡和耐藥性中起重要作用〔16〕；CASP3 可對(duì)肺癌組織較癌旁組織凋亡分子進(jìn)行調(diào)節(jié)，它可能成為進(jìn)行藥物干預(yù)的分子標(biāo)志物和靶點(diǎn)〔17〕；JUN 是ATP 刺激的血管生成基因表達(dá)的必需因子〔18〕。由上述研究可知，與肺結(jié)核通路相關(guān)的基因包括BCL2、BAX、CASP9、CASP8、JUN、CASP3，它們可能是貓爪草活性成分發(fā)揮治療肺結(jié)核作用的靶點(diǎn)。此外，本研究挖掘出ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A等其他靶點(diǎn)基因，也可作為后續(xù)的研究對(duì)象。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了貓爪草的活性成分，貓爪草中的豆甾醇、β-谷甾醇等有效化合物可能通過(guò)細(xì)胞凋亡、p53信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路，作用于BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8等靶點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)肺結(jié)核的治療作用，呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)和多通路的特點(diǎn)。除已有報(bào)道的活性成分外，還有一些有潛在治療作用的活性成分以及靶點(diǎn)蛋白，可作為后續(xù)研究的重點(diǎn)之一，可為貓爪草治療肺結(jié)核及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究奠定良好的基礎(chǔ)。