鄭增光，王鵬雁

惡性黑色素瘤是惡性程度極高的皮膚黏膜惡性腫瘤，常起病隱匿，不易引起重視，確診時多有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率僅16%[1]，且發(fā)病率有逐年升高趨勢[2]。Toll 樣受體（TLRs）是一種模式識別受體，廣泛存在于人體免疫細(xì)胞及多種上皮細(xì)胞中。最近研究表明多種腫瘤細(xì)胞表面亦表達(dá)TLRs，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。TLR4 是TLRs受體家族中的一員，可通過與配體[如脂多糖（LPS）]結(jié)合促進(jìn)炎癥介質(zhì)的合成與釋放。有研究表明TLR4 可促進(jìn)乳腺癌、卵巢癌及肺癌等腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸[3,5-6]。近年發(fā)現(xiàn)TLR4 在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)比例較高，TLR4的表達(dá)增高與患者預(yù)后差相關(guān)[7-8]。然而，TLR4 在黑色素瘤中發(fā)揮何種作用尚不明確。本研究擬采用LPS刺激A375細(xì)胞，模擬慢性炎癥的細(xì)胞微環(huán)境，探討抑制TLR4 的表達(dá)對黑素瘤A375 細(xì)胞增殖、遷移的影響及其可能的機(jī)制，以期為惡性黑色素瘤新的靶點治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤A375 細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫；青霉素-鏈霉素溶液（美國Gibco 公司）、細(xì)胞計數(shù)試劑盒CCK8（日本同仁生物公司）；胎牛血清、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；LPS（Sigma公司）；Resatorvid（Selleck 公司）；抗體TLR4、-actin（CST 公司）；IL-10 Elisa 試劑盒（酶聯(lián)生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A375 細(xì)胞株采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100 g/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在5% CO2，37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，取其對數(shù)生長期用于實驗。其中對照組細(xì)胞僅接受10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。其他組除10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基外，另加一定量的LPS 和Resatorvid 并調(diào)整相應(yīng)藥物濃度，LPS 組（LPS 5 g/ml）、TLR4 抑制組（Resatorvid 100 mol/L）、LPS+Resatorvid 組（LPS 5 g/ml+Resatorvid 100 mol/L）。

1.2.2 Western blot 檢測A375 細(xì)胞蛋白表達(dá)量 各組細(xì)胞根據(jù)分組情況，繼續(xù)培養(yǎng)48h，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后離心，吸取上清，用二喹啉甲酸（BCA）法檢測細(xì)胞蛋白濃度。在十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠上對每組取20 g 蛋白上樣，在200 V 恒壓中電泳，直到溴酚藍(lán)遷移至分離膠下緣時（時間約為40 min），關(guān)掉電源，停止電泳。然后經(jīng)過轉(zhuǎn)膜/封閉，再依次分別加入TLR4、-actin 一抗，孵育過夜，洗膜，使用二抗孵育2h，化學(xué)光敏模式曝光顯影。照片以TIFF 格式導(dǎo)出后在Image J軟件下分析各條帶灰度值，以TLR4 與-actin 灰度值比值表示各組TLR4 蛋白的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3 次。

1.2.3 CCK8 實驗檢測細(xì)胞增殖率 制備細(xì)胞懸液，將計數(shù)細(xì)胞接種到96 孔板中，待測細(xì)胞調(diào)密度至鋪滿孔底70%左右，設(shè)置3 個重復(fù)。將96 孔平底板置于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入10 l CCK-8（日本同仁公司），繼續(xù)培養(yǎng)1 ～4 h，形成結(jié)晶。使用酶標(biāo)儀450 nm波長檢測吸光度（A）值，計算細(xì)胞相對增殖率。相對增殖率（%）=（實驗組/對照組）×100%。實驗重復(fù)3 次。

1.2.4 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移能力將300 l無血清培養(yǎng)基加入到小室上層，在其下層加入800 l 培養(yǎng)基，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置2 h，將饑餓處理24h 的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，采用無血清的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為1×105/ml。去除活化時所用的培養(yǎng)基，分別在小室下層加入800 l 10% FBS 培養(yǎng)液，而小室的上層則加入300 l 細(xì)胞懸液。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，使用4%甲醇對細(xì)胞進(jìn)行固定20 min，然后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。顯微鏡下拍照（×40），隨機(jī)選取3 ～5 個視野計數(shù)。實驗重復(fù)3 次。

1.2.5 ELISA 法檢測IL-10 的表達(dá)水平各組A375 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后離心取細(xì)胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書測定IL-10 含量。采用酶標(biāo)儀繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算結(jié)果。實驗重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 和Resatorvid 對A375 細(xì)胞中TLR4 蛋白表達(dá)的影響 LPS 組TLR4蛋白表達(dá)高于空白對照組（P ＜0.05），Resatorvid 組TLR4 蛋白表達(dá)低于空白對照組（P ＜0.05）；Resatorvid+LPS 組A375細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)低于單純LPS組（P ＜0.05）。見圖1 及表1。

2.2 LPS 和Resatorvid 對A375 細(xì)胞增殖的影響 LPS 組A375 細(xì)胞相對增殖率高于空白對照組（P＜0.05），Resatorvid 組A375 細(xì)胞相對增殖率低于空白對照組（P ＜0.05），Resatorvid+LPS 組A375 細(xì)胞相對增殖率低于單純LPS 組（P ＜0.05）。見表1。

2.3 LPS 和Resatorvid對A375 細(xì)胞遷移的影響 LPS組A375 細(xì)胞遷移力高于空白對照組（P＜0.05），Resatorvi組A375 細(xì)胞遷移力低于空白對照組（P ＜0.05）；Resatorvid+LPS組A375 細(xì)胞遷移力低于LPS組（P ＜0.05）。見封二彩圖3 ～6 及表1。

2.4 各組IL-10 的表達(dá)情況 LPS 組IL-10 水平高于空白對照組（P＜0.05），Resatorvid 組IL-10 水平低于空白對照組（P ＜0.05），Resatorvid+LPS 組IL-10水平低于LPS 組（P ＜0.05）。見表1。

3 討論

TLRs是一類天然的免疫受體，最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，大量研究顯示生物的炎癥介質(zhì)與LPS 誘導(dǎo)下TLR4 信號通路激活密切相關(guān)。TLR4 在腎細(xì)胞癌、宮頸癌及肺癌等多種腫瘤及細(xì)胞系中過表達(dá)，與腫瘤的生長和侵襲遷移密切相關(guān)[5,9-10]。有研究表明TLR4 的表達(dá)與惡性黑色素瘤的進(jìn)展、化療耐藥及預(yù)后差相關(guān)[8,11]。Resatorvid（又名TAK-242）是一種選擇性的TLR4 信號傳導(dǎo)抑制劑，能抑制TLR4 及下游信號MyD88 的表達(dá)。本研究筆者通過在人黑色素瘤A375 細(xì)胞系中使用TLR4 受體抑制劑Resatorvid，結(jié)果顯示與空白對照組相比，Resatorvid 組TLR4蛋白表達(dá)下調(diào)，A375 細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯減弱（均P ＜0.05）；LPS 刺激A375細(xì)胞后，TLR4蛋白表達(dá)增加，A375細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯增強（均P＜0.05）；加入Resatorvid后，再給予相同濃度的LPS 刺激，與LPS 組相比，TLR4的表達(dá)下調(diào)，同時A375 細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降（均P ＜0.05）。

圖1 各組A375 細(xì)胞TLR4 蛋白的表達(dá)

表1 各組A375 細(xì)胞增殖、遷移能力及TLR4、IL-10 的表達(dá)水平比較

IL-10 是腫瘤發(fā)展過程中的重要免疫抑制因子，主要由Th2 細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及B 淋巴細(xì)胞等合成分泌。研究表明IL-10 參與腫瘤的免疫抑制[12-13]，一方面通過抑制腫瘤細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)，影響CTL 對腫瘤抗原的識別而發(fā)揮免疫逃逸作用；另一方面通過降低腫瘤細(xì)胞對NK 細(xì)胞的敏感性而發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤腫瘤組織中IL-10 高表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示A375 細(xì)胞系存在IL-10 的表達(dá)，與空白對照組相比，Resatorvid 抑制TLR4 的表達(dá)后，IL-10 的表達(dá)相應(yīng)降低（P ＜0.05）；LPS 激活A(yù)375細(xì)胞上TLR4 表達(dá)后，IL-10 的表達(dá)增加（P ＜0.05）；加入Resatorvid 后再給予相同濃度的LPS刺激，與LPS組相比，IL-10的表達(dá)下調(diào)（P ＜0.05）。

綜上所述，TLR4 抑制劑Resatorvid能明顯抑制TLR4 的表達(dá)，抑制黑色素瘤A375 細(xì)胞的增殖及遷移能力，其作用機(jī)制可能是通過影響腫瘤免疫微環(huán)境中免疫抑制因子的表達(dá)實現(xiàn)的。TLR4 受體有可能成為惡性黑色素瘤潛在的分子治療靶點。