曾凡洲,朱兵峰,劉志鈺,王欽超,張貴民,魏榮省

(1.魯南新時代生物技術有限公司,山東 臨沂 273400;2.魯南制藥集團股份有限公司,山東 臨沂 273400;3.哺乳動物細胞高效表達國家工程實驗室,山東 臨沂 273400)

色譜分離法在化合物的分離中應用較為廣泛,且色譜純度、回收率和分離效率等方面遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)的制備方法[7-9],其中色譜純度通過面積歸一化法得到。相比于中低壓色譜制備,高壓色譜制備效率高、柱效高。筆者以實驗室制得的紐莫康定B0粗品為原料,通過高壓制備對紐莫康定B0進行了放大中試研究,開發(fā)出了一種生產周期短、成本低和色譜純度高的制備工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

U3000高效液相色譜儀,賽默飛Thermo公司;Cs-prep150工業(yè)制備色譜系統(tǒng),漢邦科技;R-1001N型旋轉蒸發(fā)儀,鄭州長城科工貿有限公司;SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;DHJK-2020低溫冷卻循環(huán)泵,鄭州科泰實驗設備有限公司;SCIENTZ-12ND冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試 藥

工業(yè)級二氯甲烷,山東金嶺化工股份有限公司;工業(yè)甲醇,兗礦國宏化工有限責任公司;改性硅膠,蘇州納微科技股份有限公司;紐莫康定B0粗品,魯南新時代生物技術有限公司提供,質量分數81.20%;紐莫康定B0對照品,大同市礦區(qū)風華生物科技有限公司,質量分數95.56%,批號16001;紐莫康定C0對照品,大同市礦區(qū)風華生物科技有限公司贈與,質量分數95.11%,批號16002;乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為純化水。

2 實 驗

2.1 HPLC(高效液相色譜)法測定B0

紐莫康定B0檢測方法[10]:Thermo Hypersil GOLD C18,4.6 mm×250 mm,5 μm;以V(乙腈)∶V(水)=45∶55為流動相,等度洗脫;檢測波長210 nm,柱溫40 ℃,進樣量10 μL,流量1 mL/min,運行時間45 min。以紐莫康定B0對照品進行外標法定量。紐莫康定B0對照品溶液的配制:取紐莫康定B0對照品約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超聲溶解后,稀釋至刻度,搖勻,制得質量濃度為400 mg/L的紐莫康定B0對照品溶液。供試品溶液配制:對制備液用氮氣吹干,加乙醇振搖使溶解并稀釋至質量濃度約1 000 mg/L,搖勻,用0.22 μm有機濾頭過濾。紐莫康定B0的結構式為

2.2 HPLC(高效液相色譜)法測定C0

檢測方法為公司自行開發(fā),線性梯度洗脫程序如表1所示。Welch Ultimate HILIC Amide柱,4.6 mm×250 mm,3.5 μm;波長220 nm,流量1.0 mL/min,進樣量10 μL,柱溫40 ℃,流動相A為水,流動相B為乙腈。

表1 線性梯度洗脫程序

以紐莫康定C0對照品進行外標法定量,紐莫康定C0對照品溶液的配制與紐莫康定B0對照品溶液的配制相同。紐莫康定C0的結構式為

2.3 高壓制備方法的確定

初始方法為魯南新時代生物技術有限公司在50 mm高壓制備液相(漢邦科技,制備型液相色譜系統(tǒng),NS4000)上開發(fā),是以二氯甲烷、甲醇和水體系制備紐莫康定B0,國內外未見具體報道。張宇等[11]采用了氯仿、甲醇和水體系,筆者以二氯甲烷進行實驗,毒性低于氯仿[12],價格也低于氯仿,放大生產具有一定的優(yōu)越性。初始方法:將紐莫康定B0粗品(質量分數為81.2%,HPLC檢測如圖1所示,紐莫康定B0的色譜純度為88.58%、紐莫康定C0的色譜純度為8.78%)用甲醇、二氯甲烷混合溶液(V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶4)溶解,波長276 nm;柱溫20～30 ℃;流量70 mL/min;上樣量1.7 g;流動相,V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=43∶9∶1;操作壓力5～5.5 MPa。收集B0的HPLC色譜純度>95%的制備液。紐莫康定B0的色譜純度值和紐莫康定C0的色譜純度值是經過面積歸一化法得到的。以線性原則[13]放大到中試150 mm制備柱(Cs-prep150工業(yè)制備色譜系統(tǒng),漢邦科技),流量調整為630 mL/min;進樣量15.3 g;其他不變。在此基礎上,對該方法進行了進一步優(yōu)化。

圖1 紐莫康定粗品HPLC圖譜

2.3.1 流動相比例的優(yōu)化

根據正相色譜特點,通過調控二氯甲烷,對流動相比例進行優(yōu)化。在初始方法中,實驗分析了V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)的5個比例對紐莫康定B0制備分離的影響,實驗結果如表2所示。

表2 流動相比例的篩選

由表2可知:隨著二氯甲烷比例的增加,紐莫康定B0峰的保留時間逐漸增加,B0峰分離度逐漸增大,B0峰和相鄰峰的重合越小。其中,41∶9∶1和42∶9∶1的流動相比例相比,后者B0分離度高于前者,且B0峰型較好,保留時間相差不大。保留時間越長,生產成本越大。綜合考慮B0的分離效果和生產成本,故選擇V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1。

2.3.2 上樣量的優(yōu)化

上樣量在色譜制備中影響著目的峰的分離度及制備效率。因此,在流動相比例確定為V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1的基礎上,實驗選取了3種進樣量(7.5,11.4,15.3 g)對紐莫康定B0制備的效果進行研究,實驗結果如表3所示。

表3 上樣量的篩選

上樣量越大,分離度越小。對不同上樣量下的B0峰進行分段收集,并對B0的HPLC色譜純度大于95%的料液進行合并、減壓濃縮和凍干,得到凍干粉的質量分別為3.01,4.7,4.8 g。3種凍干粉B0質量分數分別為95.73%,95.77%,95.63%,相差不大。計算收率分別為47.31%,48.63%,36.95%,其表達式為

式中:X為上樣液對應粗品質量;Y為粗品B0質量分數。

由表3可知:上樣量11.4 g收率高于上樣量7.5,15.3 g。收率高,則在中試、大生產中預示著低成本、高效益,以及制藥企業(yè)在市場中較高的競爭力。因此,綜合考慮對紐莫康定B0的分離效果和收率,選擇11.4 g上樣量。

2.3.3 洗脫流速的優(yōu)化

在高壓制備液相色譜中,洗脫流速影響柱壓、峰型,進而影響到制備效率及效果。故在確定流動相比例V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1及上樣量11.4g的基礎上,考察了5個洗脫流速(480,530,580,630,680 mL/min)對紐莫康定B0制備的影響,結果如表4所示。

表4 洗脫流速的篩選

由表4知:洗脫流速越大,柱壓越高,峰型越窄。對不同洗脫流速下的B0峰進行分段收集,并對B0的HPLC色譜純度大于95%的料液進行合并、減壓濃縮和凍干。流速越大,得到的洗脫合并液體積逐漸減小,且減小幅度不大。最終得到的凍干粉質量分別為4.71,4.70,4.72,4.73,4.72 g,其各數值相差很小。

隨著流速的增加,柱壓逐漸增加,而實驗所用150 mm高壓制備系統(tǒng)工作壓力為0～7 MPa。隨著進樣次數的增加,柱壓會逐漸增高,再生柱子會越頻繁,如此會占用一定的工時和消耗再生溶劑,增加生產成本。另外,在5個流速下,凍干粉的收率和B0質量分數相差不大。綜上考慮,優(yōu)選480 mL/min的流速作為150 mm的制備柱流速。

2.4 紐莫康定B0的高壓色譜制備

以優(yōu)化后的高壓制備條件,在150 mm制備柱上進行紐莫康定B0的制備。對B0峰分段收集,連續(xù)進樣,合并紐莫康定B0的HPLC色譜純度大于95%的制備液。將合并液進行減壓濃縮,凍干,得到紐莫康定B0凍干粉。

3 結果分析

3.1 制備所得紐莫康定B0凍干粉質量分析

在優(yōu)化后的150 mm制備條件(采用正相硅膠,V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1,上樣量為11.4 g粗品,洗脫流量為480 mL/min,檢測波長分別為276,210 nm)下,上樣量共980 g,得到4批次紐莫康定B0凍干粉質量共343.7 g,其質量情況如表5所示。

表5 4批次制備凍干粉質量

由表5知:各批次凍干粉B0質量分數均大于95%(以凍干粉1為例,其HPLC檢測如圖2所示,紐莫康定B0的色譜純度為98.58%,紐莫康定C0的色譜純度為0.04%),可用于下游合成。另外,各凍干粉C0雜質均降低至0.05%以下。周永正等[15]以表面修飾了極性基團的硅膠親水材料進行層析,可以將關鍵雜質C0降至小于0.1%。相比,筆者開發(fā)的方法更能夠對紐莫康定B0的異構體C0進行有效去除,紐莫康定B0是合成醋酸卡泊芬凈的起始原料[16],因此在產品質量上,為下游合成提供了有效保證。

圖2 紐莫康定制備凍干粉HPLC圖譜

3.2 制備液穩(wěn)定性分析

王欣榮等[17]發(fā)現分離過程中紐莫康定穩(wěn)定性差的問題。在前期小試研究中,亦發(fā)現紐莫康定B0制備液常溫放置不穩(wěn)定,會有RRT1.36雜質峰出現。實驗以紐莫康定B0制備收集液為研究對象,在4 ℃冷庫(避光)的保存條件下對穩(wěn)定性進行了簡單摸索。液相檢測數據如表6所示。由表6可知:4 ℃避光條件下,B0制備液放置7 d時,B0的HPLC色譜純度降低了0.69%,RRT 0.96峰和RRT 1.14峰的HPLC色譜純度基本不變;RRT 1.36峰在放置9 d時檢測出來;13 d時,RRT 0.96峰的HPLC色譜純度降低很小,紐莫康定B0的HPLC色譜純度減小了0.71%,RRT1.14峰的HPLC色譜純度增加了0.34%,RRT1.36峰的HPLC色譜純度增加至0.27%。因此,紐莫康定B0制備液在4 ℃避光的條件下7 d內相對穩(wěn)定。在中試生產中,紐莫康定B0制備液需及時放入4 ℃冷庫中保存,需要7 d內處理完畢。在實際中試研究中,有4 ℃避光冷庫作為輔助可以保證儲藏條件,制備液放置時間為影響其穩(wěn)定性的主要因素,因此實驗中沒有考察光照、溫度對制備液穩(wěn)定性的影響。

表6 紐莫康定B0制備液的穩(wěn)定性

3.3 總收率分析

高壓制備紐莫康定B0的中試研究分4個亞批進行,總消耗紐莫康定B0的粗品質量980 g。為了對放大規(guī)模的商業(yè)化生產提供數據支持和借鑒,需要對總收率進行計算,實驗總收率計算式為

式中:E為凍干粉i的質量;F為凍干粉的B0質量分數。

經過計算,總收率為41.32%。影響總收率的因素主要有:填料、制備方法和卡泊芬凈合成對紐莫康定B0的粗品質量需求等。為了提高總收率,可以和生產填料的廠商尋求合作,開發(fā)新型改良正相硅膠,進而繼續(xù)優(yōu)化適合其使用的色譜制備方法,優(yōu)化卡泊芬凈合成后的提純工藝。亦或,統(tǒng)籌從發(fā)酵液至卡泊芬凈整體的提取工藝,達到一個合理的平衡點,以降低其對紐莫康定B0的粗品質量要求,進而可以提高紐莫康定B0高壓制備的收率。

另外,為了提高生產的總收率和降低成本,也可以將高壓制備過程中產生的HPLC色譜純度低于95%的B0制備液進行回收利用。具體方法:將低濃度制備液經過收集、濃縮和干燥后,得到回收凍干粉(HPLC檢測如圖3所示,紐莫康定B0的色譜純度為84.30%,紐莫康定C0的色譜純度為0.65%),再次進行制備回收套用。

圖3 回收凍干粉HPLC圖譜

4 結 論

以二氯甲烷、甲醇和水體系制備紐莫康定B0,國內外未見具體報道。筆者以單因素實驗的方法確定了150 mm高壓制備紐莫康定B0的條件:采用正相硅膠,V(二氯甲烷(工業(yè)))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1,上樣量為11.4 g粗品,洗脫流量為480 mL/min,檢測波長分別為276,210 nm。相比氯仿、甲醇和水體系,該制備工藝毒性小,更綠色環(huán)保。以優(yōu)化后條件,可以得到質量分數95%以上的B0干粉,能有效將B0異構體C0降至0.05%以下,為下游合成卡泊芬凈提供了更好的保證。通過對紐莫康定B0制備液穩(wěn)定性研究,制備液需及時放入4 ℃冷庫中保存,需要7 d內處理完畢,為進一步放大生產提供了數據支持。制備工藝生產周期短、成本低,且純度高。