繆明錦，黎氏文梅，趙飛亞，陶愛恩*

（1. 大理州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 大理 671000；2. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000；3. 云南大學(xué)旅游文化學(xué)院醫(yī)學(xué)院，云南 麗江 674199）

0 引言

青葉膽為龍膽科獐牙菜屬植物Svuertia mileensis T.N. Ho et W. L._Shih的干燥全草，具有退黃、除濕、舒肝健胃的功效[1]。在藏醫(yī)藥中作為治療肝炎、黃疸型肝炎、肝臟疾病的藥物[2]。主要含有環(huán)烯醚萜、三萜、生物堿等化學(xué)成分[3]，具有保肝、降血糖、抗菌及抗病毒等活性[3-4]。隨著近年來市場(chǎng)需求不斷增加，原料藥遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。而且青葉膽野生資源的匱乏，且尚無人工種植，市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多混偽品，常見為麗江獐牙菜、川西獐牙菜、大籽獐牙菜等，導(dǎo)致青葉膽臨床用藥的安全性和有效性得不到保證，嚴(yán)重干擾了藥材市場(chǎng)的正常運(yùn)行，而且對(duì)中成藥生產(chǎn)造成極大干擾，因此有必要對(duì)青葉膽藥材及其混偽品進(jìn)行快速鑒別。已有學(xué)者報(bào)道獐牙菜屬植物DNA鑒別[5]、UPLC指紋圖譜[6]、遺傳多樣性[7]，但尚未見紅外光譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)在青葉膽及其麗江獐牙菜、川西獐牙菜、大籽獐牙菜等混偽品的快速鑒別研究。鑒于此，本研究采用經(jīng)典的形態(tài)鑒別和紅外光譜鑒別手段，探討青葉膽及其混偽品的異同，以期建立一種快速、準(zhǔn)確高效的青葉膽真?zhèn)舞b定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Nexus傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)熱點(diǎn)尼高麗公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；FW-4A型粉末壓片機(jī)(天津市拓普儀器有限公司)。

1.2 材料

樣品采集于云南大理、彌勒，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院夏從龍教授鑒定為青葉膽Swertia mileensis T. N. Ho et W. L._Shih、麗江獐牙菜Swertia delavayi、大籽獐牙菜Swertia macrosperma(C. B. Clarke) C. B. Clarke、川西獐牙菜Swertia mussotii Franch.，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 原植物形態(tài)分析

4種獐牙菜屬原植物見圖1，比較莖、葉及花的特征。

2.2 供試品的制備

34批藥材干燥至恒重，粉碎過80目篩，備用。按照課題組前期方法制備供試品和數(shù)據(jù)處理分析[8]。

3 結(jié)果與分析

3.1 4種獐牙菜的形態(tài)鑒別

圖1 4種獐牙菜原植物圖

4種獐牙菜的植物形態(tài)特征見圖1。《中國(guó)華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)收載的正品青葉膽莖呈四棱形，棱上具狹翅，花冠淡藍(lán)色，下部具兩個(gè)腺窩，腺窩杯狀，僅頂端具短柔毛狀流蘇。與其比較，麗江獐牙菜莖呈圓形，花冠黃綠色，基部有一圈紫暈，基部具1個(gè)腺窩，腺窩馬蹄形，有2個(gè)黑紫色斑點(diǎn)；大籽獐牙菜莖四棱形，花冠黃綠色，中部以上具黃綠色花紋，下部具一個(gè)腺窩，半圓形，上半部邊緣具短流蘇；川西獐牙菜莖四棱形，棱上具狹翅，花冠暗紫紅色，基部?jī)蓚€(gè)腺窩，腺窩距圓形，邊緣具長(zhǎng)柔毛狀流蘇。

3.2 4種獐牙菜的平均紅外光譜對(duì)比分析

4種獐牙菜的平均紅外光譜圖見圖2，主要吸收區(qū)域?yàn)?00～400cm-1，1310～900cm-1，1500～1310cm-1，1800～1500cm-1，2800～3000cm-1，3000～3500cm-1附近，吸收峰主要集中在1800～500cm-1的范圍內(nèi)，3000～3500cm-1波段寬而大的吸收峰為O-H伸縮振動(dòng)[9]；2800～3000cm-1為烷烴C-H的伸縮振動(dòng)1800～1500cm-1波段主要表征苯環(huán)的碳骨架彎曲振動(dòng)以及C≡N，C=O、C=C等伸縮振動(dòng)；1310～900cm-1波段為單鍵的伸縮振動(dòng)區(qū)和部分含氫基團(tuán)的彎曲振動(dòng)；1500～1310cm-1主要代表了C-H的彎曲振動(dòng)；900～400cm-1波段主要為烯的碳?xì)鋸澢駝?dòng)，苯環(huán)彎曲振動(dòng)和面外彎曲振動(dòng)等。從圖2的Ⅰ區(qū)中可以看出青葉膽與其混偽品比較出現(xiàn)向上的鋸齒吸收峰差異明顯，表明不同種之間整體化學(xué)成分存在差異。

圖2 4種獐牙菜的平均紅外圖譜

3.3 4種獐牙菜的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜對(duì)比分析

對(duì)紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，可以提高譜圖的分辨率[10]。對(duì)4種獐牙菜的紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，4種獐牙菜的主要鑒別區(qū)域?yàn)棰騾^(qū)(1000～900cm-1波段)和Ⅲ區(qū)(800～500cm-1波段)，在Ⅱ區(qū)，青葉膽、圈紋獐牙菜、顯脈獐牙菜有3個(gè)向上的“鋸齒”，而紫紅獐牙菜明顯有4個(gè)向上的“鋸齒”，在Ⅲ區(qū)，4種獐牙菜向上的“鋸齒”吸收峰數(shù)目均不同。進(jìn)一步表明，青葉膽與其混偽品之間化學(xué)成分不同，麗江獐牙菜、大籽獐牙菜、川西獐牙菜能否替代青葉膽入藥，尚需研究。

圖3 4種獐牙菜的二階導(dǎo)數(shù)譜圖

3.4 PCA和PLS-DA分析

本研究對(duì)34批獐牙菜藥材的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二階求導(dǎo)等預(yù)處，導(dǎo)入SIMCA-P13.0進(jìn)行PCA和PLS-DA分析。在PCA得分圖中(圖4-a)，青葉膽單獨(dú)聚為一類，聚類效果較好；川西獐牙菜、麗江獐牙菜和大籽獐牙菜距離很近，但能明顯區(qū)分。在PLS-DA二維得分圖中(圖4-b)，青葉膽單獨(dú)聚為一類，川西獐牙菜、麗江獐牙菜和大籽獐牙菜聚為一大類，PLS-DA聚類結(jié)果優(yōu)于PCA分析。PCA和PLS-DA均能把青葉膽及其混偽品鑒別。

3.5 HCA分析

本研究對(duì)34批獐牙菜藥材的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行坐標(biāo)歸一化、二階求導(dǎo)等預(yù)處，導(dǎo)入SPSS 22.0得到數(shù)據(jù)矩陣，應(yīng)用Ward聚類法進(jìn)行系統(tǒng)分析[14]，如圖5?？梢钥闯觯嚯x為25時(shí)，4種獐牙菜可聚為1類，在距離系數(shù)為20處，4種獐牙菜聚為2類，青葉膽單獨(dú)聚為一類，川西獐牙菜，麗江獐牙菜，大籽獐牙菜聚為一類。在距離系數(shù)為5處，大籽獐牙菜單獨(dú)聚為一類，江獐牙菜與川西獐牙菜距離較近，但也能分開，HCA的聚類效果與PCA和PLS-DA分析結(jié)果一致。

4 討論

圖4 4種獐牙菜的PCA（a）和PLS-DA（b）二維得分圖

本研究采用形態(tài)鑒別和紅外光譜探討4種獐牙菜屬植物形態(tài)和整體化學(xué)成的差異。形態(tài)特征結(jié)果表明，與正品青葉膽比較，其余3種獐牙菜形態(tài)特征存在明顯差異，可作為青葉膽及其混偽品的形態(tài)鑒別依據(jù)。紅外結(jié)果表明，4種獐牙菜平均圖譜1500～500cm-1波段，二階導(dǎo)數(shù)圖譜1000～900cm-1和800～500cm-1波段內(nèi)差異較大，PCA、PLS-DA、HCA均能將青葉膽與其混偽品區(qū)分，表明4種獐牙菜整體化學(xué)成分差異較大，紅外光譜可作為青葉膽及其混偽品化學(xué)鑒別依據(jù)。青葉膽屬于2015年版《中國(guó)藥典》收載的正品藥材，主要分布于云南彌勒，資源瀕危嚴(yán)重，川西獐牙菜在藏藥中有記載用于治療肝炎、黃疸型肝炎、肝膽疾病[2]，麗江獐牙菜具有治療病毒性肝炎[15]，大籽獐牙菜具有保肝作用[16-18]，但通過形態(tài)和整體的化學(xué)成分分析，4種獐牙菜差異較大，麗江獐牙菜、大籽獐牙菜和川西獐牙菜能否替代青葉膽入藥還需進(jìn)一步研究。本研究采用形態(tài)結(jié)合紅外光譜可對(duì)青葉膽及其混偽品快速鑒別，為青葉膽質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一種科學(xué)方法。

圖5 4種獐牙菜的HCA圖