楊學(xué)芳，張繼光，吳萬(wàn)富，呂世懂*

1(昆明醫(yī)科大學(xué) 科技成果孵化中心，云南 昆明,650500)2(昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，云南 昆明,650118)3(云南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，云南 昆明,650118)4(云南昆明國(guó)家糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)站，云南 昆明,650118)

南瓜籽是葫蘆科南瓜屬植物南瓜(CucurbitamoschataDuch.)的種子[1]。南瓜籽中含有豐富的油脂，通過(guò)溶劑萃取、物理壓榨和超臨界CO2萃取等各種方式均可以制備南瓜籽油，目前主要通過(guò)低溫冷榨法制取，因?yàn)檫@樣能最大程度保留油脂中的南瓜香味及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。南瓜籽油中維生素E、甾醇、微量元素和角鯊烯等含量較高，同時(shí)，不飽和脂肪酸含量高達(dá)70%以上，主要為亞油酸和油酸[4-6]。南瓜籽油對(duì)心腦血管疾病具有預(yù)防和保健作用，且對(duì)前列腺增生具有良好的治療和預(yù)防作用[7-9]，因此開(kāi)發(fā)利用價(jià)值較大。

油脂的特征指標(biāo)，主要包括脂肪酸組成、折光指數(shù)、密度、碘值和皂化值等，是判斷油脂真實(shí)性的重要參考依據(jù)。特別是脂肪酸組成，是衡量食用油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，不同種類的油脂都有其特征脂肪酸,以及相對(duì)穩(wěn)定的脂肪酸組成比例[10]。角鯊烯是一種對(duì)人體有益的不飽和烴類化合物，由于其良好的生物活性及在食品和化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，最近幾年相關(guān)研究較多，角鯊烯在一些植物油中的含量較高，比如南瓜籽油和橄欖油[11-13]。

對(duì)南瓜籽油的相關(guān)成分進(jìn)行研究，可進(jìn)一步挖掘南瓜籽的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。目前已經(jīng)有一些文獻(xiàn)對(duì)南瓜籽油中的特征指標(biāo)和角鯊烯含量進(jìn)行了研究[14-16]，但研究的樣本數(shù)量相對(duì)較少，產(chǎn)地的覆蓋范圍有限，缺乏系統(tǒng)研究，特別是南瓜籽油中角鯊烯含量與其他油脂間的比較研究還較少。本文擬通過(guò)收集我國(guó)不同產(chǎn)地的南瓜籽油，對(duì)其特征指標(biāo)和角鯊烯含量進(jìn)行比較，并通過(guò)主成分分析法(principal component analysis,PCA)來(lái)初步探索南瓜籽油的相似及差異性，為科學(xué)評(píng)價(jià)南瓜籽油的營(yíng)養(yǎng)成分和綜合開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

10種南瓜籽油(編號(hào)為N1-N10)，市售，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和試劑

37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品(C4-C24),美國(guó)西格瑪公司；角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品,壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，純度為99.6%。KI、異辛烷、淀粉、Na2S2O3、環(huán)己烷、KOH、酚酞、ICl、甲醇、冰乙酸、石油醚(沸程30～60 ℃)，均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；95%乙醇、鹽酸、Na2SO4,均為分析純，西隴化工

股份有限公司；NaHSO4,分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；正己烷、異辛烷,均為色譜純，德國(guó)默克(Merck)公司；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用水均為一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(分度值0.000 1 g)和移液器(0.1～1 mL),瑞士梅特勒-托利多公司；GC 1310氣相色譜儀[配氫火焰離子化檢測(cè)器及變色龍數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Chromeleon 7.2)]、Trace GC1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Abbemat 3200數(shù)字式自動(dòng)折光指數(shù)測(cè)定儀、DMA 500密度計(jì),奧地利安東帕公司；Milli-Q超純水機(jī),美國(guó)密理博公司；TDL-40B高速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；SBL-15DT超聲波恒溫清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；LPD2500多管旋渦混合儀、NG150-1B氮吹儀,萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 碘值、皂化值的測(cè)定

碘值的測(cè)定參照GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂 碘值的測(cè)定》[17]；皂化值的測(cè)定參照GB/T 5534—2008《動(dòng)植物油脂 皂化值的測(cè)定》[18]。

1.3.2 折光指數(shù)的測(cè)定

采用自動(dòng)數(shù)字式折光儀進(jìn)行測(cè)定。開(kāi)機(jī)，待儀器穩(wěn)定達(dá)到測(cè)量條件后，滴加2～3滴待測(cè)油樣于棱鏡中央，蓋上樣品槽蓋，待溫度穩(wěn)定后，點(diǎn)擊測(cè)試，記錄數(shù)據(jù)，樣品測(cè)試完畢用石油醚清洗干凈后接著測(cè)試下一個(gè)樣品。

1.3.3 相對(duì)密度的測(cè)定

采用數(shù)字式密度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。開(kāi)機(jī)，待儀器穩(wěn)定達(dá)到測(cè)量條件后，用水進(jìn)行校準(zhǔn)，用注射器吸取一定量的樣品潤(rùn)洗3次后，注入一定量的樣品(確保無(wú)氣泡)，儀器自動(dòng)顯示被測(cè)對(duì)象的相對(duì)密度，測(cè)定完成后，用下一個(gè)待測(cè)油樣清洗系統(tǒng)后再測(cè)，測(cè)定完成后，用石油醚把系統(tǒng)清洗干凈再關(guān)機(jī)。

1.3.4 脂肪酸組成的測(cè)定

采用氣相色譜法，參照GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》[19]第三法，采用面積歸一化法定量，用100 m的毛細(xì)管柱進(jìn)行分離，確保37種脂肪酸甲酯均能實(shí)現(xiàn)良好分離，具體的前處理過(guò)程、氣相色譜條件以及計(jì)算過(guò)程同文獻(xiàn)[20]。

1.3.5 角鯊烯含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)室采用GC-MS測(cè)定南瓜籽油中角鯊烯的含量，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量研究。前處理的操作步驟和儀器條件參考文獻(xiàn)[21]。同時(shí)從線性范圍、儀器精密度和加標(biāo)回收率等方面對(duì)所使用的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果能滿足分析要求。具體的前處理過(guò)程為：稱取0.5 g南瓜籽油樣品(精確至0.000 1 g)于15 mL離心管中，加入2 mol/L的KOH-乙醇溶液4 mL，75 ℃超聲波皂化40 min，取出離心管，冷卻至室溫，加入4 mL一級(jí)水、3 mL正己烷，渦旋振蕩提取5 min，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層(正己烷層)至10 mL刻度離心管中，然后再用正己烷提取2次，每次3 mL，均取上層(正己烷層)至10 mL刻度離心管中，然后在50 ℃氮吹儀上吹干，用10 mL正己烷定容，取部分定容液4 000 r/min離心5 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)。如果試樣測(cè)出的濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，則需要進(jìn)一步稀釋后再測(cè)。

1.3.5.1 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品至燒杯中，加入少許正己烷溶解，移入10 mL棕色容量瓶后，用正己烷定容，充分混勻，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液，避光冷藏備用。然后再用移液器準(zhǔn)確移取1 mL上述儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，充分混勻，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的中間液。利用該中間液，用正己烷逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和40.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.5.2 GC-MS條件

GC條件：賽默飛TG-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱：初始溫度200 ℃， 保持1 min；20 ℃/min 升到310 ℃保持5 min；載氣為高純He(純度99.999%)；流速 1.0 mL/min；SSL進(jìn)樣口，溫度300 ℃，分流進(jìn)樣，分流流量10 mL/min，分流比為10∶1。MS條件：質(zhì)譜傳輸線溫度300 ℃，離子化模式EI，溫度280 ℃，掃描模式SIM，其中定量離子的荷質(zhì)比69，定性離子的荷質(zhì)比81、95和137，溶劑延遲時(shí)間5 min。

1.4 結(jié)果計(jì)算與數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)2次，結(jié)果以平均值表示。其中碘值、皂化值和脂肪酸組成的結(jié)果計(jì)算同GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂 碘值的測(cè)定》[17]、GB/T 5534—2008《動(dòng)植物油脂 皂化值的測(cè)定》[18]、GB 5009.168—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測(cè)定》[19]；密度和折光指數(shù)的數(shù)值由儀器直接顯示，取值保留到小數(shù)點(diǎn)后4位；碘值、皂化值保留到小數(shù)點(diǎn)后1位；脂肪酸組成和角鯊烯的結(jié)果保留3位有效數(shù)字。PCA采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SIMCA-P15。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜籽油特征成分分析

分別對(duì)10個(gè)南瓜籽油樣品的特征指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析，其中37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示，南瓜籽油樣品(編號(hào)為N1)的色譜圖如圖2所示，特征指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

從圖1可知，37種脂肪酸甲酯混標(biāo)能得到較好分離，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在試驗(yàn)過(guò)程中加了有證書的質(zhì)控樣，檢測(cè)結(jié)果均滿意。由表2可知，南瓜籽油的相對(duì)密度為0.918 8～0.921 5；折光指數(shù)為1.456 0～1.466 9；碘值為108.4～116.2 g/100 g；皂化值為188.9～192.4 mg/g；10個(gè)南瓜籽油中共檢出14種脂肪酸，主要為亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸，以不飽和脂肪酸為主，含量為78.2%～82.0%。通過(guò)色澤判斷部分南瓜籽油的加工工藝不相同，但特征指標(biāo)組成及含量均很接近，說(shuō)明加工工藝對(duì)油脂特征指標(biāo)的影響不大。柴杰等[22]對(duì)葵花籽油整個(gè)精煉過(guò)程中的品質(zhì)變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)整個(gè)精煉過(guò)程脂肪酸組成及含量變化較小，與本文結(jié)果一致。另外，有研究發(fā)現(xiàn),南瓜籽油中不飽和脂肪酸的含量和橄欖油、葵花籽油、油茶籽油等中的含量接近，都在80%左右[16,23-25]。從營(yíng)養(yǎng)平衡的角度考慮，油脂中具有較高含量的油酸和亞油酸，對(duì)人體健康具有重要意義。從測(cè)定結(jié)果可以看出，南瓜籽油具有較高含量的油酸和亞油酸，因此，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，開(kāi)發(fā)前景很大。

圖1 37種脂肪酸甲酯混標(biāo)色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of 37 mixed fatty acid methyl ester standards

圖2 南瓜籽油樣品(N1)的脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of fatty acid methyl esters in the pumpkin seed oil sample (No.N1)

表2 十個(gè)南瓜籽油特征指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Test results of characteristic indexes in 10 pumpkin seed oil samples

2.2 南瓜籽油中角鯊烯含量的比較分析

2.2.1 南瓜籽油中角鯊烯含量的測(cè)定

按照1.3.5的方法和條件，分別對(duì)10個(gè)南瓜籽油樣品的角鯊烯含量進(jìn)行分析，其中角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS-SIM圖如圖3所示，南瓜籽油樣品(N1)的角鯊烯的GC-MS-SIM圖見(jiàn)圖4,10個(gè)南瓜籽油樣品角鯊烯含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 SIM掃描模式下角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of squalene standard in SIM scan mode

圖4 SIM掃描模式下南瓜籽油樣品(N1)的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of pumpkin seed oil sample in SIM scan mode (No.N1)

表3 十個(gè)南瓜籽油樣品中角鯊烯含量檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test results of squalene in 10 pumpkin seed oil samples

從表3可知，10個(gè)南瓜籽油含鯊烯含量范圍較大，最低的為N8，310 mg/kg；最高的為N4，檢測(cè)結(jié)果為4 446 mg/kg。可能與制油的工藝有關(guān)，此結(jié)果也說(shuō)明了南瓜籽中含有較高含量的角鯊烯。本實(shí)驗(yàn)所用的10個(gè)南瓜籽油樣品均用物理壓榨的方式來(lái)制油，但是從油脂的色澤(圖5)可以看出，盡管都是采用物理壓榨方式，但有些南瓜籽油是經(jīng)過(guò)粗加工后(比如用低溫冷榨機(jī)榨取后過(guò)濾)制取的，而有的可能是在粗加工的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)加酸、加減、脫色、脫臭等處理后精煉而成的。在顏色較深的南瓜籽油中，角鯊烯含量比顏色淺的南瓜籽油高，即N3、N4、N5、N6和N9中含量均高于其他南瓜籽油，其中N4和N6號(hào)樣品標(biāo)簽上標(biāo)示的就是低溫壓榨；而N1和N8號(hào)樣品可能就是因?yàn)楣に嚨脑蚨鴮?dǎo)致角鯊烯的部分損失，其含量明顯低于其他南瓜籽油。柴杰等[22]的研究也表明，精煉過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致葵花籽油角鯊烯含量大幅降低。南瓜籽油中角鯊烯含量較高，具有較大的開(kāi)發(fā)研究?jī)r(jià)值，至于含量差異較大的原因，可能是不同的制油工藝所致。

圖5 南瓜籽油樣品的色澤圖Fig.5 Color of pumpkin seed oil samples

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12,26-27]，橄欖油的角鯊烯含量較高(>1 000 mg/kg)，為了進(jìn)一步和其他油脂進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)選取了一些特種木本油脂做對(duì)比，分別是茶葉籽油、橄欖油、美藤果油、橡膠籽油、鐵核桃油、澳洲堅(jiān)果油和牛油果油，每種選取3個(gè)樣品，測(cè)定了這些油脂中的角鯊烯含量。結(jié)果表明，核桃油中角鯊烯含量為28.6～34.0 mg/kg；澳洲堅(jiān)果油中含量為80.6～304 mg/kg；茶葉籽油中含量為125～251 mg/kg；橄欖油中含量為1 232～7 176 mg/kg；牛油果油中含量為190～258 mg/kg；而美藤果油和橡膠籽油中角鯊烯含量均小于10 mg/kg?？梢钥闯?，南瓜籽油中的角鯊烯含量是唯一能和橄欖油相媲美的。

2.2.2 角鯊烯的線性范圍、加標(biāo)回收率和精密性考察

目前，角鯊烯測(cè)定采用LS/T 6120—2017《糧油檢驗(yàn) 植物油中角鯊烯的測(cè)定 氣相色譜法》[28]，但該方法前處理較為繁瑣，不適合大批量樣品的處理，所以本實(shí)驗(yàn)參考呂春玲等[21]的方法。

為盡可能覆蓋不同樣品的角鯊烯含量范圍，設(shè)定的線性范圍較寬，0.50～40.0 μg/mL，對(duì)應(yīng)覆蓋的檢測(cè)范圍為10～800 mg/kg，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 0；峰面積的RSD值為1.79%，精密度符合要求。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)做了2個(gè)梯度水平的加標(biāo)回收率，10 mg/kg的加標(biāo)回收率為79.2%，100 mg/kg的加標(biāo)回收率為101.0%，回收率也滿足分析要求。

2.3 主成分分析

為進(jìn)一步探索這些南瓜籽油的聚類情況，把10個(gè)樣品的特征指標(biāo)和角鯊烯含量進(jìn)行主成分分析。PCA是基于降維的思想，把多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)，通過(guò)平面坐標(biāo)可在總體上對(duì)樣品進(jìn)行一致性的分析，而一般的統(tǒng)計(jì)技術(shù)只能對(duì)某一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[29-31]。主成分分析的樣品得分圖見(jiàn)圖6。

圖6 基于特征指標(biāo)和角鯊烯含量的10個(gè)南瓜籽油的主成分得分圖Fig.6 PCA score scatter plot based on the content of squalene and characteristic indexes in the 10 pumpkin seed oil samples

前2個(gè)主成分中，解釋方差的累積值R2X為0.714，當(dāng)前變量的預(yù)測(cè)能力Q2為0.235，對(duì)應(yīng)主成分 1和2 的解釋率：R2X[1]和R2X[2] 分別為0.441和0.273，Hotelling’s T2(95%)時(shí)，所有樣品均在灰色圓圈(Ellipse)內(nèi)，說(shuō)明沒(méi)有異常值。從圖6可以看出，10個(gè)南瓜籽油分成了幾個(gè)區(qū)域，其中N8號(hào)樣品和其他樣品離得很遠(yuǎn)，這可能和其角鯊烯含量較其它樣品低有關(guān)。N1、N2、N10、N7聚合很近，N3、N9、N6、N4、N5則聚在左邊，這種聚合和油脂所顯的色澤也基本吻合，說(shuō)明最主要的原因可能還是由于油脂加工工藝的不同，導(dǎo)致了它們?cè)谝恍┏煞稚系牟町?尤其是角鯊烯含量)，從而在主成分得分圖上形成了各自的聚類與區(qū)分。

3 結(jié)論

本文對(duì)我國(guó)不同產(chǎn)地的南瓜籽油的特征成分和角鯊烯含量進(jìn)行了分析，以期為南瓜籽的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論支撐。結(jié)果表明，南瓜籽油的相對(duì)密度為0.918 8～0.921 5；折光指數(shù)為1.456 0～1.466 9；碘值為108.4～116.2 g/100 g；皂化值為188.9～192.4 mg/g；脂肪酸組成中，以亞油酸和油酸為主，不飽和脂肪酸含量為78.2%～82.0%；南瓜籽中角鯊烯含量較高，和橄欖油相當(dāng)，顯著高于茶葉籽油、核桃油、澳洲堅(jiān)果油和牛油果油等特種木本油脂，但本次實(shí)驗(yàn)所選的南瓜籽油角鯊烯含量范圍較大，最低為310 mg/kg，最高為4 446 mg/kg，結(jié)合PCA、油脂色澤和角鯊烯含量綜合判斷，可能和油脂的制取工藝有關(guān)?？傊瞎献延褪且环N營(yíng)養(yǎng)成分較好，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值和推廣的特種木本油脂。