劉靜怡 蘇姍娜 何慧潔 王慧敏 張冬

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因[1]，隨著工業(yè)化、城市化及環(huán)境污染肺癌病因也變得更加復(fù)雜，由于早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，同時缺乏敏感的篩查指標(biāo)，大部分患者明確診斷時已處于晚期，失去手術(shù)治療的機會，同時放療、化療毒副作用較大，不能高度特異性地殺傷腫瘤細胞，且容易復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，故患者的預(yù)后較差[2]。Cullin1蛋白是Cullin家族的一員，目前在人類基因組中，Cullin蛋白家族共有8個成員，Cullin1為SCF復(fù)合體（Skp1-Cul-F-box）的重要組成部分，可介導(dǎo)參與細胞周期進程中許多蛋白質(zhì)的蛋白酶體的降解，一旦Cullin1的調(diào)節(jié)機制發(fā)生異常，SCF復(fù)合體功能也相應(yīng)發(fā)生變化，使癌細胞發(fā)生積累或腫瘤抑制因子的過度降解，導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生[3,4]。近年來研究表明Cullin1與惡性腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，已有研究表明在腎癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中異常表達[5-7]，而肺癌中少有報道，本研究擬探討Cullin1對肺腺癌A549和H1395細胞生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌細胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮細胞BEAS-2B（中國科學(xué)院干細胞庫），RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶（美國Hyclone公司產(chǎn)品）、胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），TRIzol試劑（上海Invitrogen公司），siRNA Cullin1（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（賽默飛世爾科技公司），四甲基偶氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium assay, MTT）試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），Transwell（上海碧云天公司），基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）抗體、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1, TIMP-1）抗體、Cyclin D1抗體、Cyclin E2抗體、p21抗體、p27抗體（上海貝晶生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）試劑盒SYBR Premix Ex Taq、細胞周期檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和內(nèi)參β-actin抗體（北京瀚海拓新生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 將肺腺癌細胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮細胞BEAS-2B分別置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和LHC-9培養(yǎng)基中，放置于37oC、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞株篩選 利用TRIzol分別提取肺腺癌細胞（A549、H358、H1395、H1650）和BEAS-2B細胞中RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)實時定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq進行實驗，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算肺腺癌細胞和BEAS-2B中Cullin1 mRNA表達。選取表達量相對較高的兩株肺腺癌細胞進行后續(xù)的干擾實驗。

1.4 轉(zhuǎn)染及分組 將選取的兩株肺腺癌細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)基中，放置于 37oC、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞，以每孔2×105個細胞接種于6孔板中，放置于37oC、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，采用瞬時轉(zhuǎn)染，根據(jù)Lipo2000說明書，將siRNA轉(zhuǎn)染入細胞中，在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)48 h，4 h-6 h換液。分為siRNA干擾組（si-Cullin1組）及對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的肺腺癌細胞，NC組）。

1.5 MTT法 取對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化，置成細胞懸液，密度為2×104個/mL，按2,000個/孔接種于96孔板，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于第1、2、3、4、5天取出96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測定各孔在490 nm處的OD值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的細胞，用PBS清洗2遍，加入胰酶適度消化細胞，離心5 min，用預(yù)冷的PBS重懸細胞，加入預(yù)冷的70%乙醇，吹打均勻，放入4oC冰箱固定過夜，離心，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入100 μL RNase A，于37oC孵育30 min，再加入400 μL PI并充分混勻，4oC下避光培養(yǎng)30 min，應(yīng)用細胞流式儀分析細胞周期。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，用PBS洗滌2次，加入胰酶消化，1,000 rpm，離心5 min，棄上清液，將細胞重懸于500 μL的Binding Buffer后，再加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，加入5 μL PI染色，避光條件下反應(yīng)15 min，在流式細胞儀下進行檢測。

1.8 Transwell侵襲實驗 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞數(shù)為3×104個/mL；在上室內(nèi)均勻的覆蓋稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠，在24孔板的底部加入500 μL含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基，每孔加入200 μL的細胞懸液，繼續(xù)在37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出上室，擦凈，將上室加入800 μL的甲醇，室溫下固定30 min，用臺盼藍進行染色，上室底部朝上晾干，放置在倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.9 Transwell遷移實驗 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞數(shù)為2×104個/mL，在24孔板的底部加入500 μL含10%的血清的培養(yǎng)基，在上室中加入200 μL的細胞懸液，繼續(xù)在37oC、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，擦凈，固定，染色，計數(shù)方法同前。

1.10 Western blot 胰酶消化、離心、加入蛋白酶抑制劑以及RIPA裂解液，離心取上清液于EP管中，提取總蛋白，用二奎啉甲酸法（BCA法）測定蛋白濃度；取40 μg蛋白以10%SDS-PAGE電壓為100 V，電泳90 min，分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4oC冰箱孵育過夜；第二日，室溫下復(fù)溫30 min，用TBST洗滌3次，5 min/次，加入二抗，室溫下孵育2 h，孵育好后，洗滌方法同上，利用Odyssey紅外熒光掃描，以β-actin為內(nèi)參。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間差異比較采用t檢驗進行分析；檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計圖使用GraphPad 8.0軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 Cullin1在肺腺癌細胞株及人正常肺上皮細胞BEAS-2B中的表達 采用實時定量PCR檢測肺腺癌細胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮細胞BEAS-2B中Cullin1 mRNA的表達水平，以人正常肺上皮細胞BEAS-2B為參照，Cullin1 mRNA在肺腺癌細胞中均呈高表達，在肺腺癌A549和H1395細胞中的表達相對較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），因此選取這兩株肺腺癌細胞進行后續(xù)的實驗（圖1）。

2.2 MTT實驗 肺腺癌A549和H1395細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，第4天開始si-Cullin1組A549和H1395細胞OD值低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），第5天si-Cullin1組A549和H1395細胞OD值明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

2.3 干擾Cullin1后對細胞周期的影響 與NC組比較，si-Cullin1組A549和H1395細胞處于G1期的細胞增多，S期細胞減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3A、圖

3B）。

2.4 干擾Cullin1后對細胞早期凋亡的影響 與NC組比較，si-Cullin1組A549和H1395細胞早期凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3C、圖3D）。

2.5 Transwell細胞侵襲實驗 肺腺癌A549和H1395細胞經(jīng)Cullin1 siRNA轉(zhuǎn)染后，與NC組相比，穿過Transwell小室的細胞數(shù)分別下降57%、42%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4A、圖4B）。

圖 1 qRT-PCR檢測肺腺癌細胞（A549、H358、H1395、H1650）及人正常肺上皮細胞BEAS-2B中Cullin1 mRNA的表達。與人正常肺上皮細胞BEAS-2B相比：*P＜0.05。Fig 1 The expression of Cullin1 mRNA in lung adenocarcinoma cells (A549, H358, H1395, H1650) and human normal lung epithelial cells BEAS-2B by qRT-PCR. Compared with human normal lung epithelial cells BEAS-2B: *P＜0.05. qRT-PCR: quantitative real time polymerase chain reaction.

2.6 Transwell細胞遷移實驗 肺腺癌A549和H1395細胞經(jīng)Cullin1 siRNA轉(zhuǎn)染后，與NC組相比，穿過Transwell小室的細胞數(shù)分別下降52%、35%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4C、圖4D）。

圖 2 MTT法檢測干擾Cullin1后對肺腺癌A549（A）和 H1395（B）細胞增殖的影響。*P＜0.05，**P＜0.01。Fig 2 The effect of interference with Cullin1 on proliferation of lung adenocarcinoma A549(A) and H1395(B) cells was detected by MTT assay . *P＜0.05, **P＜0.01. OD: optical density; MTT: methyl thiazolyl tetrazolium assay.

2.7 CyclinD1、CyclinE2、p21、p27蛋白表達水平 與NC組相比，肺腺癌A549細胞CyclinD1蛋白表達水平下降55%，CyclinE2蛋白表達水平下降53%，而p21蛋白表達增加30%，p27蛋白表達增加34%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5A、圖5B）。而H1395細胞CyclinD1蛋白的表達水平降低了39%，CyclinE2蛋白的表達水平降低了48%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而p21蛋白表達增加25%，p27蛋白表達增加31%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5C）。

2.8 干擾Cullin1對MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白水平的影響 與NC組相比，肺腺癌A549細胞的MMP-9蛋白表達水平降低48%，MMP-2蛋白表達水平降低60%；而TIMP-1蛋白表達增加78%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05） （圖6A，圖6B）。H1395細胞MMP-9蛋白表達水平降低16%，MMP-2蛋白表達水平降低52%（P＜0.05），TIMP-1蛋白表達增加38%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖6C）。

3 討論

近幾年，隨著肺腺癌相關(guān)基因研究不斷深入，許多有關(guān)肺腺癌生長和發(fā)展的基因被發(fā)現(xiàn)，更多的治療方法也不斷出現(xiàn)[8,9]。Cullin1蛋白是Cullin家族功能最廣泛的成員，是SCF復(fù)合體的一種支架蛋白，可以調(diào)節(jié)多種蛋白因子，如p21、p27和p53等，同時也參與調(diào)節(jié)細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄等過程。關(guān)于Cullin1與惡性腫瘤之間的研究也越來越多，Min等[10]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中Cullin1的表達與預(yù)后因素如組織學(xué)分級高及p53蛋白表達相關(guān)，與治療標(biāo)志物如ER陰性、HER2陽性密切相關(guān)，Cullin1高表達與總生存率低顯著相關(guān)，同時Cullin1調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Bai等[11]發(fā)現(xiàn)干擾Cullin1后可以使胃癌細胞增殖能力下降，將細胞周期阻滯在G1期，可以降低細胞黏附能力，而癌細胞黏附于靶組織是癌轉(zhuǎn)移侵襲和遷移的關(guān)鍵步驟。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)Cullin1高表達與肝癌的TNM分期及不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Cullin1的高表達可使大腸癌細胞停滯在細胞周期G1期，同時能夠促進腫瘤的增殖和侵襲，Cullin1高表達與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)[13,14]。

圖 3 流式細胞術(shù)檢測干擾Cullin1后對肺腺癌A549和H1395細胞周期及早期凋亡的影響。A：流式細胞術(shù)檢測細胞周期；B：肺腺癌A549和H1395細胞周期的柱狀圖比較；C：流式細胞術(shù)檢測細胞早期凋亡數(shù)量；D：肺腺癌A549和H1395細胞早期凋亡率的柱狀圖比較。*P＜0.05。Fig 3 Flow cytometry to detect the effect of interference with Cullin1 on the cell cycle and early apoptosis of lung adenocarcinoma A549 and H1395. A: Flow cytometry to detect cell cycle; B: Comparison of lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells cycle histograms; C: Flow cytometry to detect the number of early apoptosis; D: Comparison of histograms of early apoptosis rate of lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. *P＜0.05.

腫瘤細胞的主要特征是有較高的增殖能力，且遠遠超過正常細胞[15]。在本研究中，實時定量PCR結(jié)果顯示肺腺癌細胞（A549、H358、H1395、H1650）中Cullin1 mRNA表達水平較人正常肺上皮細胞BEAS-2B增高，尤其在肺腺癌細胞A549和H1395中最顯著，后續(xù)實驗采用肺腺癌A549和H1395細胞進行。通過MTT法和流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖、細胞周期及早期凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Cullin1表達后，肺腺癌A549和H1395的增殖能力受到明顯的抑制，G1期細胞數(shù)量較對照組明顯增加，S期細胞數(shù)量減少，細胞早期凋亡率明顯增加，干擾Cullin1表達后可使細胞周期進程停滯在G1期，從而抑制了細胞的增殖。細胞異常的增殖通常與細胞周期的調(diào)節(jié)相關(guān)，主要與細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent protein kinases, CDKs）有關(guān)，CDKs是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，在控制細胞分裂和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮著重要作用，其活性主要受細胞周期蛋白調(diào)控[15]。細胞周期蛋白屬于一個傳統(tǒng)保守的蛋白家族，在特定的細胞周期階段表達，從而調(diào)節(jié)CDKs的活性[16]。有文獻[17]報道細胞周期蛋白D（Cyclin D）、細胞周期蛋白E（Cyclin E）或者細胞周期蛋白A（Cyclin A）和CDKs形成的復(fù)合物可促進細胞周期進程。p21和p27是細胞周期蛋白依賴性激酶家族的成員，它們通過阻止細胞從G1期進入S期而發(fā)揮抑癌作用，p21和p27的功能是抑制Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表達水平[18,19]。Cullin1通過泛素化蛋白水解系統(tǒng)調(diào)節(jié)Cyclin D1、Cyclin E2及CDKs抑制劑p21和p27的表達，該蛋白水解系統(tǒng)失調(diào)可能導(dǎo)致增殖失控[20]。本研究通過Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表達量減少，而p21和p27蛋白表達量增多，表明干擾Cullin1后導(dǎo)致泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能障礙，p21和p27蛋白的積累進一步導(dǎo)致Cyclin D1和CyclinE2蛋白表達量減少。Cyclin D1和Cyclin E2蛋白表達量的減少，使肺腺癌細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變的進程受到影響，細胞周期停滯，從而抑制了細胞的增殖。

圖 4 Transwell實驗檢測干擾Cullin1后肺腺癌A549和H1395細胞侵襲及遷移的能力。A：侵襲實驗檢測穿過基底膜細胞數(shù)量；B：肺腺癌A549和H1395細胞侵襲率的柱狀圖比較；C：遷移實驗檢測穿過基底膜細胞數(shù)量；D：肺腺癌A549和H1395細胞遷移率的柱狀圖比較。*P＜0.05。Fig 4 The ability of invasion and migration of lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells was detected by Transwell experiment after interference with Cullin1. A: The invasion experiment detected the number of cells passing through the basement membrane; B: Histogram comparison of cell mobility in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells; C: The migration experiment detected the number of cells passing through the basement membrane; D: Histogram comparison of cell mobility in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. *P＜0.05.

腫瘤的轉(zhuǎn)移是在一系列復(fù)雜的細胞侵襲-轉(zhuǎn)移級聯(lián)上完成的，通過周圍環(huán)境侵入局部的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）和基質(zhì)細胞層，在轉(zhuǎn)移部位重新啟動增殖程序，從而造成腫瘤的發(fā)生[21]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，主要作用是破壞ECM，同時使腫瘤血管生成增加[22]，腫瘤間質(zhì)中MMPs水平升高與腫瘤細胞浸潤或轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[23]。MMP-2和MMP-9屬于MMPs家族成員，主要作用是降解基底膜和ECM的基本成分IV型膠原，從而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，特別是MMP-2被認(rèn)為在腫瘤侵襲的初始步驟中起著重要作用；MMP-9在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮作用，并介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境的改變[24,25]。TIMPs是MMPs的天然抑制劑，現(xiàn)已有四位家族成員，分別為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，其家族成員均能與MMPs形成1:1的共價復(fù)合物，抑制MMPs的活性。TIMP-1不僅有抑制MMPs活性的功能，還參與多種生物學(xué)活動，包括細胞分化、生長、遷移、侵襲、血管生成和凋亡[26]。本研究通過細胞侵襲和遷移實驗，發(fā)現(xiàn)干擾Cullin1后兩種肺腺癌細胞（A549和H1395）的侵襲和遷移能力都出現(xiàn)了明顯的下降；為了進一步研究其機制，通過Western blot實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)si-Cullin1組細胞的MMP-9、MMP-2的蛋白表達量較對照組下降，而TIMP-1蛋白表達量則增加，這可能是由于TIMP-1蛋白表達的上調(diào)抑制了MMP-9、MMP-2活性有關(guān)，從而導(dǎo)致侵襲和遷移能力的下降。

圖 5 Western blot檢測Cyclin D1、Cyclin E2、p21和p27在肺腺癌A549和H1395細胞中的蛋白表達含量。A：Western blot驗證CyclinD1、CyclinE2、p21和p27表達；B：肺腺癌A549細胞中相對灰度值表達比較柱狀圖（*P＜0.05）；C：肺腺癌H1395細胞中相對灰度值表達比較柱狀圖。*P＜0.05。Fig 5 Western blot was used to detect the protein content of Cyclin D1, Cyclin E2, p21 and p27 in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. A: Western blot to verify the protein expression of Cyclin D1, Cyclin E2, p21 and p27; B: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma A549 cells (*P＜0.05); C: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma H1395 cells. *P＜0.05.

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Cullin1在肺腺癌細胞中高表達，干擾Cullin1能明顯阻滯肺腺癌細胞的增殖，使細胞周期停滯于G1期，同時使肺腺癌細胞侵襲及遷移的能力降低，提示Cullin1可能作為肺腺癌治療新的潛在靶點。

Author contributions

Liu JY and Zhang D conceived and designed the study. Liu JY, and Su SN performed the experiments. Wang HM and He HJ analyzed the data. Liu JY and Zhang D contributed analysis tools. Liu JY and Zhang D provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

圖 6 Western blot檢測MMP-9、MMP-2和TIMP-1在肺腺癌A549和H1395細胞中的表達蛋白的含量。A：Western blot驗證MMP-9、MMP-2和TIMP-1表達；B：肺腺癌A549細胞中相對灰度值表達比較柱狀圖；C：肺腺癌H1395細胞中相對灰度值表達比較柱狀圖。*P＜0.05。Fig 6 Western blot was used to detect the protein content of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1 in lung adenocarcinoma A549 and H1395 cells. A: Western blot to verify the protein expression of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1; B: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma A549 cells; C: The histogram of relative gray value expression comparison in lung adenocarcinoma H1395 cells . *P＜0.05. MMP: matrix metalloproteinase; TIMP: tissue inhibitor of metalloproteinase.