樊黎明 田原 孫穎 胡志東

在世界范圍的癌癥中，肺癌是導(dǎo)致死亡的重要原因，其發(fā)病率、死亡率都很高，在中國，肺癌也是最常見的癌癥類型[1]。其中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占比超過83%，主要包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等[2]。早期肺癌經(jīng)過根治手術(shù)切除，其5年生存率最高可達(dá)80%以上，但75%的NSCLC患者診斷時(shí)已處于中晚期，治療方式主要有手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療，其5年生存率低于30%[3]。因此，需要進(jìn)一步探索肺癌的生物學(xué)特點(diǎn)及其分子作用機(jī)制，而尋找早期診斷肺癌的方法對于提高肺癌治愈率、改善肺癌患者預(yù)后顯得尤為重要。

Lipocalin-2（LCN2），又名24p3、SIP24、NGAL，是一種小分子分泌型蛋白，最早被Hraba-Renevey等[4]在小鼠的腎臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。Lipocalin-2是Lipocalin超家族中的一員。Lipocalin-2作為一種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在多種細(xì)胞中表達(dá)，與感染性疾病、炎性腸疾病、神經(jīng)退化性疾病、肥胖與代謝綜合征等相關(guān)[5]。Lipocalin-2和腫瘤的發(fā)生發(fā)展也相關(guān)。本研究旨在通過檢測Lipocalin-2在肺癌血清中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 該研究共檢測了60例肺癌患者和63例健康對照者外周血血清標(biāo)本中的Lipocalin-2表達(dá)情況，肺癌患者外周血取自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2014年5月-2014年12月收治的患者。肺癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均為初診并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肺癌，且術(shù)前未行放療、化療、靶向藥物治療及生物治療等。60例肺癌患者中，男性37例，女性23例，中位年齡63歲（45歲-81歲），既往有吸煙史38例，無吸煙史22例；腫瘤最大徑≤3 cm 25例，＞3 cm 35例；腺癌40例，鱗癌20例，低分化22例，中-低分化9例，中分化18例，高分化11例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。63例健康對照者中，男性36例，女性27例，中位年齡57歲（36歲-78歲）。本項(xiàng)研究通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者的知情同意。1.2 研究方法 采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELSIA）檢測血清中的Lipocalin-2表達(dá)情況。其中ELISA試劑盒購自美國R&D公司（貨號(hào)：DLCN20）。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書操作。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將所需試劑復(fù)溫后，首先向每一個(gè)檢測孔中加入100 μL的稀釋液，然后加入標(biāo)椎品、對照及實(shí)驗(yàn)樣品，4oC孵育2 h后洗掉孔內(nèi)液體，再加入200 μL偶聯(lián)試劑，4oC孵育2 h，用洗滌液清洗后加入200 μL底物溶液，室溫孵育30 min后加入終止液，最后檢測吸光度（optical density, OD450）。將肺癌患者及健康對照者的血清，經(jīng)ELISA試劑盒檢測其中Lipocalin-2的表達(dá)后，通過標(biāo)準(zhǔn)樣品計(jì)算各組血清中Lipocalin-2的具體濃度，然后通過比較分析各個(gè)不同類型肺癌患者血清中Lipocalin-2的含量，最后統(tǒng)計(jì)Lipocalin-2表達(dá)量與肺癌患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件（Chicago, IL, USA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 8（San Diego, CA, USA）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，肺癌患者及健康人對照者血清Lipocalin-2濃度使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）描述，統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lipocalin-2在外周血中的濃度比較 Lipocalin-2在肺癌患者外周血血清中的濃度明顯高于健康對照者［(204.4±81.78) ng/mL vs (86.83±23.13) ng/mL］，兩者之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1。

2.2 Lipocalin-2在肺癌患者外周血血清中的濃度和臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性 利用ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Lipocalin-2濃度與和肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，肺癌患者外周血血清Lipocalin-2濃度與患者年齡、性別、吸煙史無相關(guān)性，而與病理組織的分化、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Lipocalin-2在病理分化差的肺癌患者血清中的表達(dá)高于分化良好患者；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者血清中的表達(dá)高于沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者；在臨床III期+IV期肺癌患者中的表達(dá)水平顯著高于臨床I期+II期患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖 1 Lipocalin-2在肺癌患者及健康正常人外周血中的濃度Fig 1 Lipocalin-2 level in peripheral blood of lung cancer patients and healthy people

表 1 肺癌患者外周血血清中的Lipocalin-2濃度和臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性（n=60）Tab 1 Correlation between serum Lipocalin-2 level and clinical features in patients with lung cancer (n=60)

3 討論

Lipocalin-2（LCN2），又名中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL），在多種腫瘤組織及細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，比如肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等[6]。在乳腺癌中，Lipocalin-2的表達(dá)和腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，在乳腺癌進(jìn)展期II期和III期中高表達(dá)，并且在發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的尿液中也呈現(xiàn)高表達(dá)，可用于乳腺癌患者的預(yù)測[7]。Lipocalin-2在高度惡性子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，預(yù)示著不良的總生存期及無病生存期，具有重要的預(yù)后意義[8]。在前列腺癌組織中，Lipocalin-2的表達(dá)和腫瘤的侵襲相關(guān)，并且和腫瘤細(xì)胞的侵襲能力相一致[9]。

Lipocalin-2在腫瘤中的功能主要通過以下幾點(diǎn)實(shí)現(xiàn)：①通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[7,10]顯示Lipocalin-2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞促進(jìn)了腫瘤的原位侵襲與生長；②Lipocalin-2可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，Lipocalin-2作為鐵結(jié)合蛋白參與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，Lipocalin-2介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鐵含量抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡[11,12]；③Lipocalin-2通過與其他蛋白的相互作用調(diào)控腫瘤的進(jìn)展，在胰腺癌中MUC4通過人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase, AKT）/核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）途徑調(diào)節(jié)Lipocalin-2表達(dá)[13]。

Lipocalin-2在一些腫瘤患者血清中的表達(dá)也呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，其在甲狀腺乳頭狀癌患者血漿中的含量提高，與臨床參數(shù)呈現(xiàn)相關(guān)性[14]。Lipocalin-2在IV期宮頸癌患者血清中的濃度高于I期[15]，但Lipocalin-2在肺癌血清中的研究較少。

本研究采用ELISA法檢測Lipocalin-2在60例肺癌患者與63例健康人群外周血血清中的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Lipocalin-2在肺癌患者外周血血清中的表達(dá)水平明顯高于健康人群，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。Lipocalin-2在肺癌患者中的表達(dá)與病理組織的分化、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過進(jìn)一步與肺癌的病理特征比較發(fā)現(xiàn)，Lipocalin-2在病理分化差的肺癌患者血清中的表達(dá)高于分化良好患者；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者血清中的表達(dá)高于沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者；在臨床III期+IV期肺癌患者血清中的表達(dá)水平顯著高于臨床I期+II期患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示，Lipocalin-2可能作為一種潛在的肺癌腫瘤標(biāo)志物用于臨床診斷。

綜上所述，Lipocalin-2在肺癌患者血清水平中高表達(dá)，其與病理組織的分化、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有望成為一種潛在的新型肺癌腫瘤標(biāo)志物用于臨床診斷。本研究納入的樣本量較少，不足以用于臨床診斷，但為進(jìn)一步大規(guī)模的檢測奠定了基礎(chǔ)，為臨床應(yīng)用提供了參考。

Author contributions

Fan LM and Hu ZD conceived and designed the study. Fan LM performed the experiments. Fan LM and Tian Y analyzed the data. Fan LM and Sun Y contributed analysis tools. Fan LM and Hu ZD provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.