陳宇 張智 汪凡棟 宋昭君 劉元彬 唐龍 廖偉 鄭佳狀△

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是由外創(chuàng)傷引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。大多數(shù)脊髓損傷伴有生理生化異常和結(jié)構(gòu)損傷，會導(dǎo)致神經(jīng)損傷和神經(jīng)再生，從而引起嚴(yán)重的運(yùn)動和感覺通路功能障礙，且這些影響均是不可逆的[2]。SCI創(chuàng)傷后立即引起原發(fā)性損傷，后續(xù)發(fā)展為繼發(fā)性損傷，此時受損神經(jīng)組織發(fā)生一系列的病理過程，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與自噬等[3-4]，使得神經(jīng)功能出現(xiàn)障礙。通過預(yù)防或減輕繼發(fā)性損傷來盡可能地保留受損組織或挽救脊髓中受損細(xì)胞是脊髓損傷治療的關(guān)鍵措施。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)來源于骨髓，具有多向分化的潛能，目前已運(yùn)用于多種組織修復(fù)中。BMSCs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子可以為神經(jīng)組織和神經(jīng)元提供營養(yǎng)和保護(hù)。例如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在軸突生長和神經(jīng)元分化中起重要作用，可以促進(jìn)BMSCs的神經(jīng)元分化和神經(jīng)組織再生[5]。超聲介導(dǎo)的微泡破壞可增強(qiáng)向腫瘤的藥物輸送，是一種新型、可耐受的靶向治療策略，超聲技術(shù)中探頭的中心頻率通常為1～5 MHz，聲壓范圍為0.1～0.5 MPa，從而引起聲空化。作為氣泡的核心，微泡在超聲場中不斷壓縮、膨脹和塌陷，從而增強(qiáng)了聲音的氣泡效應(yīng)并產(chǎn)生了一系列機(jī)械效應(yīng)，增加了細(xì)胞膜和微血管的滲透性，從而有助于藥物遞送[6-8]。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠SCI模型，觀察BMSCs和超聲微泡單獨(dú)或聯(lián)合移植對脊髓損傷后神經(jīng)恢復(fù)的作用，為BMSCs移植治療脊髓損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 分組與處理

將造模成功的50只大鼠隨機(jī)分為5組，包括：假手術(shù)組、模型組、超聲微泡組、BMSCs 組、超聲微泡+BMSCs組。制模后第2天，超聲微泡組和超聲微泡+BMSCs組大鼠經(jīng)尾靜脈注入1 mL濃度約2×108個/mL的超聲微泡溶液，并經(jīng)胸診斷超聲輻照10 min(頻率5 MHz，機(jī)械指數(shù)為1.3，輻照5 s)，每次間隔5 s，第4天和第6天重復(fù)超聲輻照微泡操作，共3次。同時制模后第2天假手術(shù)組、模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注入1 mL生理鹽水，BMSCs 組和超聲微泡+BMSCs組大鼠經(jīng)尾靜脈注入干細(xì)胞懸液(1×107個細(xì)胞混懸于2 mL PBS中)于2 min內(nèi)緩慢注入。

1.2 動物模型制作

參照文獻(xiàn)[9]方法構(gòu)建SD大鼠SCI模型。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠俯臥固定于實驗臺上，碘伏消毒后，沿大鼠背部正中逐層皮膚組織，暴露T9～T11椎板，在T10錐板顯露脊髓，做長約2.5 cm 的正中切口，分離椎旁肌肉，將T9～T11的棘突和椎板完全切除暴露脊椎，在實驗臺上安裝固定打擊器，將直徑為2 mm 的10 g打擊錘從5 cm的高度處自由落下撞擊T10脊髓，擊打后迅速移開打擊錘，觀察錐擊瞬間鼠尾痙攣性擺動，雙后肢及軀體出現(xiàn)回縮撲動視為造模成功。大鼠傷口處常規(guī)消毒表面，并逐層縫合皮膚和肌肉，將其放置在37 ℃動物飼養(yǎng)箱內(nèi)直至麻醉完全清醒，每天早晚對大鼠的膀胱進(jìn)行按摩，以便于排尿，連續(xù)3 d 給予大鼠腹腔注射青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠僅暴露脊柱，不進(jìn)行錐擊 T10脊髓。

1.3 實驗材料

DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，聲諾維超聲微泡造影劑購于意大利博萊科公司，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑和尼氏染色試劑購自北京康為世紀(jì)生物公司，IL-1β，TNF-α，IL-6 ELISA試劑盒購自上海碧云天生物研究所，RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及實時定量 PCR試劑盒均購于日本TaKaRa 公司，抗體Nestin和GFAP購自美國Santa Cruz 公司，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG與Alexa Fluor 594標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自美國 Cell Signaling公司。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分離

脫臼法處死SD大鼠，在無菌條件下分離取出大鼠的股骨和脛骨，應(yīng)用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓沖洗液，尼龍網(wǎng)過濾，緩慢加入等體積的Percoll分離液(1.077 g/mL)，在離心機(jī)中以2 000 r/min離心20 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌后再次離心，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，按1×106/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，將有粘附于培養(yǎng)底壁的細(xì)胞棄掉。之后每3 d更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞基本長滿瓶底壁時，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌，滴加0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，并以1∶2比例傳代，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，繼續(xù)消化并傳代。

1.5 BBB評分

分別于術(shù)后第1，7，21天對各組大鼠的后肢運(yùn)動功能進(jìn)行BBB(Basso Beattie and Bresnahan)評分[10]，分為22個等級。評分均采用雙人雙盲獨(dú)立觀察與記錄，對實驗結(jié)果進(jìn)行平均以減少誤差。

1.6 HE染色

評分結(jié)束后，采用10%水合氯醛麻醉大鼠并處死。其中，5只大鼠脊髓組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，另外5只大鼠脊髓組織標(biāo)本在液氮迅速冷凍后，于-80 ℃下保存。將脊髓組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，切成約4 μm 的切片，進(jìn)行HE染色。將石蠟切片置于55 ℃烤箱烘烤30 min，二甲苯脫蠟，酒精水化，蘇木精染色液染色5 min，伊紅染色液染色1 min，PBS洗滌后以梯度酒精脫水，二甲苯中透明10 min，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓組織病理損傷程度。

1.7 ELISA 法

取100 mg脊髓組織，加入裂解緩沖液(pH7.4)后研磨勻漿，4 ℃低溫離心機(jī)中以1 500 r/min離心15 min，獲取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒檢測脊髓組織中IL-1β，TNF-α，IL-6的表達(dá)，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值，并計算各因子含量。

1.8 尼氏染色

將固定后的脊髓組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切成30 μm厚的切片，蒸餾水洗滌，梯度酒精脫水，尼氏染色檢測尼氏體形態(tài)變化。將切片浸入0.1%甲苯酚紫溶液染色5 min，蒸餾水洗滌，使用乙醇脫水分化，二甲苯中透明5 min，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體形態(tài)學(xué)變化。

1.9 免疫熒光染色

將骨髓組織石蠟切片置于室溫下干燥2 h，PBS洗滌后，滴加0.3% TritonX-100 于37 ℃下孵育15 min，PBS洗滌后，加入5%山羊血清封閉1 h，之后加入稀釋后的一抗抗體Nestin(1∶500)和GFAP(1∶500)，4 ℃ 孵育過夜，次日PBS洗滌，加入相應(yīng)的稀釋的熒光二抗(1∶250)，37 ℃ 孵育2 h，PBS再次洗滌，加入DAPI染色10 min，中性樹膠封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照，使用ImageJ2x軟件對熒光圖片進(jìn)行測定分析，記錄染色陽性區(qū)域面積占總面積的百分比。

1.10 實時熒光定量PCR

將保存于-80 ℃冰箱的脊髓組織取出并剪碎，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR實驗，以 GAPDH 作為內(nèi)參，檢測BDNF，NT3，Caspase-3，Bax，Bcl-2 mRNA 的表達(dá)情況，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性20 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 45 s，循環(huán) 40 次，實驗重復(fù) 3 次。結(jié)果采用2ΔΔCt法計算各基因的表達(dá)水平。采用Primer Premier5軟件設(shè)計基因引物序列(見表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時間點BBB評分比較

對各組大鼠進(jìn)行BBB評分的檢測結(jié)果顯示：在術(shù)后第1，7，21天，模型組、超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分均顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后第1天超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05 )；術(shù)后第7天和第21天，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分與模型組比較顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分顯著高于超聲微泡組和BMSCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后第1，7，21天BBB運(yùn)動功能評分比較

2.2 各組大鼠檢測脊髓組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；模型組脊髓組織結(jié)構(gòu)明顯損傷，出現(xiàn)脊髓充血、水腫等現(xiàn)象，脊髓空洞較大，炎癥細(xì)胞浸潤增多；超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織病理損傷較模型組明顯得到改善，炎癥細(xì)胞浸潤得到抑制，見圖1。

圖1 HE染色檢測大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)變化(×100)

2.3 各組大鼠脊髓組織中炎性因子表達(dá)比較

ELISA檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組、超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均顯著減少(P<0.05)，且超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量較超聲微泡組和BMSCs組顯著減少(P<0.05)，見表 3。

表3 各組大鼠脊髓組織中IL-1β，TNF-α及IL-6含量比較

2.4 各組大鼠脊髓組織中尼氏小體形態(tài)觀察比較

尼氏染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組脊髓組織中尼氏小體形態(tài)清晰，模型組尼氏小體出現(xiàn)模糊不清、變小甚至消失的現(xiàn)象；超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中尼氏小體形態(tài)有所恢復(fù)，融合現(xiàn)象減少，且超聲微泡+BMSCs組比超聲微泡組和BMSCs組尼氏小體融合更少，形態(tài)恢復(fù)更為明顯，見圖2。

圖2 尼氏染色檢測大鼠脊髓組織尼氏小體形態(tài)變化(×100)

2.5 各組大鼠脊髓組織中Nestin和GFAP表達(dá)比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組脊髓組織Nestin和GFAP標(biāo)記的熒光表達(dá)強(qiáng)度較高，而模型組中少有Nestin和GFAP標(biāo)記的熒光表達(dá)；超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中Nestin和GFAP標(biāo)記的熒光表達(dá)較模型組增加，且超聲微泡+BMSCs組比超聲微泡組和BMSCs組的表達(dá)增加更多，見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測大鼠脊髓組織Nestin和GFAP表達(dá)(×200)

2.6 各組大鼠脊髓組織中BDNF，NT3，Caspase-3，Bax及Bcl-2 的mRNA表達(dá)比較

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組、超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Bax及Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時，與超聲微泡組和BMSCs組比較，超聲微泡+BMSCs組中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Bax及Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠脊髓組織BDNF，NT3，Caspase-3，Bax及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量

3 討論

在脊髓損傷中由于原發(fā)性損傷已經(jīng)發(fā)生，因此大多數(shù)療法的目標(biāo)是防止因繼發(fā)性損傷機(jī)制而造成的損害，這種損害在初次傷害后的數(shù)小時至數(shù)周內(nèi)發(fā)生，機(jī)制主要包括血管功能障礙、水腫、局部缺血、炎癥、電解質(zhì)轉(zhuǎn)移、自由基產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡[3-4]。減輕繼發(fā)性損傷脊髓中受損的細(xì)胞是脊髓損傷治療的一項措施。為了實現(xiàn)這一措施，有效的策略是改善病變部位的微環(huán)境，從而進(jìn)一步抑制神經(jīng)元的損失。

近年來，隨著對SCI發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究，BMSCs移植已成為SCI治療領(lǐng)域的一項突破。盡管研究表明，BMSCs可以減輕損傷和促進(jìn)軸突再生，但依靠干細(xì)胞在損傷區(qū)的歸巢能力來治療的療效一般。已有研究表明，通過將目的基因與超聲微泡結(jié)合后導(dǎo)入機(jī)體內(nèi)，超聲輻照后生的空化效應(yīng)，可以使目的基因更容易進(jìn)入細(xì)胞，實現(xiàn)靶向治療的目的[11]。超聲微泡可以使組織血管壁或其他屏障產(chǎn)生微孔，來促進(jìn)血液和組織進(jìn)行物質(zhì)交換，使得藥物更容易穿過血脊髓屏障[12]。此外，超聲微泡聯(lián)合干細(xì)胞移植在心肌梗死中可以促進(jìn)VEGF來刺激血管新生，并改善心肌微環(huán)境[13]。本研究結(jié)果顯示，在術(shù)后第7天和第21天，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組大鼠BBB評分較模型組均明顯增加，且超聲微泡+BMSCs組BBB評分要高于超聲微泡組和BMSCs組，同時脊髓組織病理現(xiàn)象較模型組明顯得到改善，尼氏小體形態(tài)有所恢復(fù)。因此，推測超聲微泡聯(lián)合BMSCs對大鼠脊髓損傷具有明顯的改善作用。

脊髓受到損傷后外源性和內(nèi)源性有害物質(zhì)會通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致一系列的并發(fā)癥，嚴(yán)重危害脊髓損傷的恢復(fù)。脊髓損傷中繼發(fā)性損傷伴隨著多種病理生理機(jī)制，其中炎癥反應(yīng)能夠大大促進(jìn)脊髓損傷的發(fā)展[14]。Paterniti等[15]研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后幾小時內(nèi)，促炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和iNOS的水平明顯升高；Okada[16]揭示脊髓損傷繼發(fā)性損傷的級聯(lián)引起病變部位的炎癥反應(yīng)不斷擴(kuò)大并擴(kuò)散到周圍組織，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時抑制了組織再生與功能恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示：模型組脊髓組織中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均增加，超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量均減少，且超聲微泡+BMSCs組中IL-1β，TNF-α及IL-6含量較超聲微泡組和BMSCs組減少更為明顯。由此表明超聲微泡聯(lián)合BMSCs能夠抑制脊髓損傷大鼠脊髓組織內(nèi)炎癥反應(yīng)。

引起運(yùn)動和感覺神經(jīng)元繼發(fā)性死亡最多的神經(jīng)損傷之一是細(xì)胞凋亡，脊髓損傷后神經(jīng)微環(huán)境失衡，細(xì)胞凋亡增加，神經(jīng)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用，并參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展，神經(jīng)細(xì)胞的死亡能夠加劇神經(jīng)退行性疾病。本研究發(fā)現(xiàn)超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組脊髓組織中Nestin和GFAP標(biāo)記的熒光表達(dá)較模型組增加，且超聲微泡+BMSCs組比超聲微泡組和BMSCs組的表達(dá)增加更多。Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，GFAP通常被用于鑒定分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。此外，本研究結(jié)果還顯示：超聲微泡組、BMSCs組和超聲微泡+BMSCs組中BDNF，NT3及Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量較模型組明顯升高，Bax及Caspase-3 mRNA相對表達(dá)量下降，且超聲微泡+BMSCs組中這些基因表達(dá)升高或下降程度較超聲微泡組和BMSCs組更為明顯。BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)元分化、增殖和成熟的作用，也是突觸可塑性和記憶形成的主要驅(qū)動力[5，17]。NT3是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一個活性營養(yǎng)因子，可以特異性作用于急性受損的脊髓組織，以維持神經(jīng)元存活，促進(jìn)增殖和分化，誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長并促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)[18]。Bcl-2具有抑制凋亡的功能，可通過影響線粒體膜的通透性來調(diào)控細(xì)胞凋亡，而Bax可以與Bcl-2結(jié)合形成異二聚體，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在線粒體凋亡途徑中，釋放到胞漿中的Cyt-c能夠與凋亡誘導(dǎo)因子相互作用激活Caspase，其中Caspase-3是多種細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵因子之一[19]。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)超聲微泡聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠脊髓損傷發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用，這對超聲微泡聯(lián)合BMSCs臨床治療脊髓損傷提供了實驗依據(jù)，并對全面研究脊髓損傷的修復(fù)機(jī)制具有重要意義。

致謝 感謝川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉天橋老師在動物實驗中給予的指導(dǎo)和幫助。