許銀銀 蔣澤天 熊桃秀 雷珊珊 李波 陸婷婷 俞巧仙 呂圭源 陳素紅*

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是臨床上較常見的一種消化系統(tǒng)疾病，具有包括餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛、上腹燒灼感等癥狀，經(jīng)各項檢查排除相關(guān)器質(zhì)性病變的疾?。?］。研究顯示，當(dāng)前全球FD 的患病率為10%～30%［2］，本病一般病程較長，影響患者生活，且容易反復(fù)發(fā)作，難以徹底治愈［3］。中醫(yī)藥治療功能性消化不良在緩解癥狀、減少復(fù)發(fā)等方面具有其特色和優(yōu)勢［4］。鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛的干燥莖，藥用歷史悠久。《神農(nóng)本草經(jīng)》曰：“久服厚腸胃，輕身延年”。鐵皮石斛“厚腸胃”的療效可使胃腸生理強壯，胃腸功能增強，表現(xiàn)為維護(hù)胃腸健康和促進(jìn)功能改善［5-10］。鐵皮石斛益消方在鐵皮石斛“厚腸胃”的藥效基礎(chǔ)上配伍“疏肝解郁”中藥加減組方，有利于鐵皮石斛防治FD 等胃腸道疾病的藥物研究與開發(fā)，以期開發(fā)防治肝胃不和型FD 的方藥。FD 被認(rèn)為是生物因素和社會心理因素共同作用的體現(xiàn)，胃腸動力障礙與精神情志障礙是導(dǎo)致FD 發(fā)病的重要因素，腦腸軸功能的異常是發(fā)病的核心機(jī)制［11］。本實驗?zāi)M人“情志不暢”加“飲食不節(jié)”的不良生活方式，采用夾尾刺激復(fù)合饑飽失常法制備肝胃不和型FD 大鼠模型，通過觀察鐵皮石斛益消方對FD 大鼠的胃腸功能以及相關(guān)腦腸肽指標(biāo)評價綜合藥效，同時為探索其可能的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 72 只SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)環(huán)境：保持飼養(yǎng)房通風(fēng)良好，燈光照明12 h/d，溫度22～25 ℃，濕度60%～70%。

1.2 藥物與試劑 鐵皮石斛（批號20180610）購自浙江森宇有限公司，香附（批號1906035）購自浙江英特醫(yī)藥股份有限公司，枸櫞酸莫沙必利分散片（批號190425）購于成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，大鼠胃動素（MTL）（批號201912）、大鼠血管活性肽（VIP）（批號201912）、大鼠5-羥色胺（5-HT）（批號201912）ELISA 試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，胃蛋白酶試劑盒（批號20191217）購于南京建成生物生物工程研究所；H&E 染色液（批號J22D9Y78310）購于上海源葉生物科技有限公司。受試藥的制備：鐵皮石斛益消方（鐵皮石斛、香附等藥材煎煮濃縮而成）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所制備，取復(fù)方加蒸餾水浸泡煎煮，取濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至生藥濃度為1.16、0.58、0.29 g/ml，置4 ℃冰箱備用。陽性藥的配制：枸櫞酸莫沙必利分散片（規(guī)格5 mg/片），與蒸餾水配比成濃度0.15 mg/ml 的混懸液，置4 ℃冰箱備用。半固體營養(yǎng)糊的制備［12］：將10 g 羧甲基纖維素鈉溶于250 ml蒸餾水中，依次加入16 g 奶粉、8 g 白糖、8 g 淀粉和2ml 黑色墨汁，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制備約300 ml 左右的黑色半固體糊，置4 ℃冰箱備用。

1.3 儀器 EPOCH2C 酶標(biāo)儀（美國Bio Tek），VIP5JR脫水機(jī)（日本SAKURA），RM2245 切片機(jī)（德國LEICA公司），JPWS-10T 超純水儀（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申盛生物科技有限公司），MiCRoc117 離心機(jī)（德國Thermo），BAS124S 電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋（常州諾基有限公司），P10/P200/P1000移液槍（德國Eppendorf）。

1.4 造模與給藥方法 72 只SPF 級健康SD 大鼠，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，稱重，隨機(jī)分成正常組，模型組，莫沙必利組，鐵皮石斛益消方高、中、低劑量組（11.66、5.83、2.92 g/kg），每組12 只。采用饑飽失常復(fù)合夾尾刺激法造模：每天晚上9 點到第2 天早上9 點禁食，飲水自由；夾尾法刺激大鼠，用紗布包裹止血鉗輕度鉗夾鼠尾后1/3 處，立即放開，30 min/次，2 次/d。正常組大鼠不予任何干預(yù)。造模2 周后各給藥組每天上午分別給予陽性藥或受試藥（10 ml/kg）1 次/d，正常組和模型組灌胃等量飲用水，邊造模邊給藥，連續(xù)2 周。

1.5 觀察指標(biāo) （1）體質(zhì)量、進(jìn)食量、背溫的測定：給藥期間，每天下午14 ∶00 對大鼠進(jìn)行稱重記錄。每日上午9 ∶00 每籠大鼠給予100 g 普通固體飼料，至晚上9 ∶00，記錄每籠大鼠的日進(jìn)食量，并計算平均每只大鼠的日進(jìn)食量。用紅外溫度顯示儀測背溫并拍照，用FIRE 軟件處理圖像。（2）血清D-木糖的測定：給藥2 周后，每只大鼠禁食、不禁水18 h 后，按照10 ml/kg 的灌胃劑量灌胃3%的D-木糖，1 h 后眼眶取血備用。根據(jù)間苯三酚法檢測血清D-木糖的濃度。（3）胃殘留率和小腸推進(jìn)率的測定：末次給藥后，禁食18 h（自由飲水），大鼠灌胃給予半固體營養(yǎng)糊1 ml/100 g。20 min 后腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉開腹，剪取完整的胃，將胃內(nèi)容物取下，剔除胃表面黏膜，擦凈表面粘液、血液，稱量全胃重量，然后沿胃彎處剪開胃體，以生理鹽水洗去胃內(nèi)固體糊，拭干后拍照并稱量胃凈重。胃殘留率（%）=胃殘留物重（g）/灌胃的營養(yǎng)糊重（g）×100%。剪取腸管幽門至回盲部，用卷尺測量腸管的長度，即小腸總長度；測量幽門至碳墨前沿的距離，即碳墨在小腸內(nèi)推進(jìn)的距離。小腸推進(jìn)率（%）=碳墨推進(jìn)長度（cm）/小腸總長度（cm）×100%。（4）血清指標(biāo)檢測：大鼠麻醉后腹主動脈采血，3500 r/min離心10 min，分離上層血清備用。采用ELISA 法檢測大鼠血清中MTL、VIP、5-HT 的含量。（5）胃蛋白酶活力檢測：取大鼠胃組織，按比例加入勻漿介質(zhì)，組織勻漿機(jī)碾磨，取上清液，嚴(yán)格按照胃蛋白酶測試盒說明書操作。（6）胃組織病理學(xué)觀察：取大鼠胃組織置于4%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水后，包埋切片，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠一般體征、體質(zhì)量及進(jìn)食量情況 正常組大鼠毛色光澤，精神狀態(tài)良好，活動自如，排便正常。模型組大鼠毛色灰暗，稀疏易脫，精神萎靡，易怒，喜打斗，或扎堆聚集，排便量減少，糞便質(zhì)地改變，偶見不成形，也有質(zhì)地干硬。經(jīng)藥物干預(yù)后，給藥組大鼠精神狀態(tài)有所改善，行動敏捷，大便成形。

2.2 鐵皮石斛益消方對FD 大鼠體重的影響 見表1。

表1 鐵皮石斛益消方對FD大鼠體重的影響［n=12，（±s）］

表1 鐵皮石斛益消方對FD大鼠體重的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別 給藥劑量 造模2 周（g） 給藥2 周（g） 體重增長率（%）正常組 - 283.08±36.21 373.95±50.38 32.10模型組 - 252.99±25.43* 300.20±33.90# 18.66莫沙必利組 1.56 mg/kg 253.43±23.81* 335.83±45.45 32.51鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 252.76±23.78* 333.44±39.46 31.92鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 252.82±25.47* 336.53±44.06 33.11鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 253.05±23.79* 330.77±41.48 30.71

2.3 鐵皮石斛益消方對FD 大鼠攝食量的影響 見表2。

表2 鐵皮石斛益消方對FD大鼠攝食量的影響［n=12，（±s）］

表2 鐵皮石斛益消方對FD大鼠攝食量的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

組別 劑量 攝食量（g）給藥1 周 給藥2 周正常組 - 24.47±3.40 19.60±1.61模型組 - 15.04±2.20* 15.58±0.19*莫沙必利組 1.56 mg/kg 20.06±0.80 ▲ 19.59±4.29鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 18.83±0.89# 19.11±2.00#鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 22.79±0.82 ▲ 19.23±1.99#鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 19.57±1.73# 20.91±3.59#

2.4 對模型大鼠背溫的影響 見表3 和圖1。

表3 鐵皮石斛益消方對大鼠背溫的影響［n=12，（±s）］

表3 鐵皮石斛益消方對大鼠背溫的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量 背溫（℃）正常組 - 29.45±1.94模型組 - 31.14±0.40*莫沙必利組 1.56 mg/kg 30.77±0.60鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 30.64±1.36鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 30.34±0.88#鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 30.46±0.67#

圖1 鐵皮石斛益消方對大鼠背溫的影響。注：A． 正常組；B． 模型組；C． 莫沙必利組；D． 鐵皮石斛益消方高劑量組；E． 鐵皮石斛益消方中劑量組；F． 鐵皮石斛益消方低劑量組

2.5 對模型大鼠血清D-木糖含量的影響 見表4。

表4 鐵皮石斛益消方對大鼠血清D-木糖的影響［n=12，（±s）］

表4 鐵皮石斛益消方對大鼠血清D-木糖的影響［n=12，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量 血清D-木糖（μmol/L）正常組 - 0.22±0.04模型組 - 0.16±0.04*莫沙必利組 1.56 mg/kg 0.18±0.06鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 0.20±0.05#鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 0.19±0.03#鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 0.17±0.03

2.6 對模型大鼠胃內(nèi)殘留率及小腸推進(jìn)率的影響 見圖2。

圖2 鐵皮石斛益消方對模型大鼠胃內(nèi)殘留率（A）及小腸推進(jìn)率（B）的影響。注：與正常組比較，★P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01

2.7 對模型大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響 胃黏膜大體觀結(jié)果顯示，各組大鼠胃黏膜成淺紅色，皺襞正常，無明顯潰瘍、糜爛和出血點（見圖3），各組大鼠胃黏膜無明顯形態(tài)學(xué)改變。進(jìn)一步的HE 染色結(jié)果顯示，正常組和各給藥組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞完整，下層可見少量中性粒細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列整齊，腺體排列比較整齊；模型組可少見腺體缺失，可見充血的毛細(xì)血管，部分上皮細(xì)胞脫落，無明顯病理形態(tài)學(xué)改變（見圖4）。

圖3 鐵皮石斛益消方對胃黏膜大體觀的影響。注：A． 正常組；B． 模型組；C． 莫沙必利組；D． 鐵皮石斛益消方高劑量組；E． 鐵皮石斛益消方中劑量組；F． 鐵皮石斛益消方低劑量組

圖4 鐵皮石斛益消方對大鼠胃黏膜病理形態(tài)影響（HE，×200）。注：A．正常組；B． 模型組；C． 莫沙必利組；D． 鐵皮石斛益消高劑量組；E． 鐵皮石斛益消中劑量組；F． 鐵皮石斛益消方低劑量組

2.8 對模型大鼠胃蛋白酶活力的影響 見表5。

表5 鐵皮石斛益消方對大鼠胃蛋白酶活力的影響［n=8，（±s）］

表5 鐵皮石斛益消方對大鼠胃蛋白酶活力的影響［n=8，（±s）］

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量 胃蛋白酶活力（u/mgprot）正常組 24.18±2.77模型組 20.88±2.19*莫沙必利組 1.56 mg/kg 23.39±2.07#鐵皮石斛益消方高劑量組 11.66 g/kg 23.05±2.77鐵皮石斛益消方中劑量組 5.83 g/kg 23.95±3.97鐵皮石斛益消方低劑量組 2.92 g/kg 21.92±2.81

2.9 對模型大鼠血清MTL、VIP、5-HT 含量的影響 見圖5。

圖5 鐵皮石斛益消方對大鼠血清MTL（A）、VIP（B）及5-HT（C）的影響。注：與正常組比較，★P＜0．05，★★P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01

3 討論

功能性消化不良在中醫(yī)學(xué)屬于“痞滿”、“胃脘痛”范疇［13］。中華中醫(yī)藥學(xué)會脾胃病分會在2017 年的《消化不良中醫(yī)診療共識意見》中，根據(jù)中醫(yī)辨證將FD 分為脾虛氣滯證、肝胃不和證、脾胃濕熱證、脾胃虛寒（弱）癥和寒熱錯雜證五類。其中肝胃不和證是臨床上最為常見的類型之一，本證大多為情志不舒，肝郁氣滯而影響胃腸功能，或飲食損傷胃氣，胃病及肝所致。多以理氣解郁，和胃降逆法治之。鐵皮石斛益消方中以鐵皮石斛清火養(yǎng)胃生津；香附，疏肝解郁，理氣寬中，兩者共為君藥。綜合全方，散收并用，疏養(yǎng)結(jié)合，肝脾胃同治，氣血兼顧，共奏疏肝理氣，調(diào)脾和胃之功。

本實驗采用了夾尾刺激模擬人的“情志不暢”、“怒傷肝，久則郁”，制作大鼠肝郁模型；復(fù)合不規(guī)則喂養(yǎng)法，模擬人的“飲食不節(jié)”、“饑飽失常，腸胃乃傷”，造成大鼠胃腸動力障礙。兩種復(fù)合因素造模，更符合FD臨床發(fā)病情況。本實驗發(fā)現(xiàn)模型大鼠毛發(fā)凌亂，精神萎靡，易怒或蜷縮在角落，自主活動能力減少，同時體重和攝食量顯著下降，胃腸動力顯著下降，小腸吸收能力下降，成功制備出符合肝胃不和型的FD 大鼠模型。

鐵皮石斛益消方的藥效實驗結(jié)果顯示，大鼠給予鐵皮石斛益消方后，體重和攝食量均有一定程度的恢復(fù)，還可改善肝郁內(nèi)熱所導(dǎo)致的背溫升高。由于D-木糖在小腸吸收后，不被肝臟代謝，直接被小腸黏膜吸收進(jìn)入血液，所以血清D-木糖常被用來評價小腸的吸收功能。實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清D-木糖含量顯著降低，小腸吸收能力減弱。給藥鐵皮石斛益消方后，大鼠血清D-木糖含量有所提高，提示鐵皮石斛益消方可以提高小腸的吸收能力。胃內(nèi)殘留率和小腸推進(jìn)率是研究胃腸功能的基本實驗方法，為評價FD 嚴(yán)重程度的兩個最主要指標(biāo)。與正常組相比，模型組胃內(nèi)殘留量顯著升高，小腸推進(jìn)率顯著下降，鐵皮石斛益消方給藥后增強了模型大鼠的胃排空能力和小腸推動能力，初步證實了鐵皮石斛益消方治療FD 的效果。

雙向腦-腸相互作用在FD 患者中起著重要作用，腦-腸肽如MTL、VIP 等來源于胃腸道的物質(zhì)被輸送至血液循環(huán)中，下丘腦通過來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的激素信號和外周神經(jīng)信息調(diào)節(jié)生理功能。本實驗也進(jìn)一步研究了鐵皮石斛益消方治療對FD 相關(guān)的腦腸肽（MTL、VIP、5-HT）水平的影響。MTL 和VIP 作為胃腸動力相關(guān)的腦腸肽在調(diào)節(jié)胃腸運動中發(fā)揮著重要作用。MTL 是由上小腸分泌的含有22 個氨基酸的肽，可通過增強遷移運動復(fù)合物通過內(nèi)分泌和神經(jīng)途徑刺激胃腸運動收縮。VIP 是一種28 個氨基酸的神經(jīng)肽，該神經(jīng)肽參與許多生理腸道功能，在胃腸道中抑制胃腸運動及胃排空、減慢小腸運動等作用。臨床發(fā)現(xiàn)FD 患者的胃排空障礙、收縮力減弱、小腸運動減弱與血漿MTL 水平的降低［14］、VIP 水平的升高有關(guān)［15］。在給藥組中，造模導(dǎo)致血清MTL 和VIP 水平顯著改善。因此，模型組中大鼠血清MTL 的減少和VIP 的升高可能是FD 胃腸動力減弱癥狀的原因之一，鐵皮石斛益消方通過提高其水平促進(jìn)了胃腸動力功能。

5-HT 是一種具有多重生物學(xué)效應(yīng)的腦腸肽，具有促進(jìn)胃腸道運動、刺激胃腸激素分泌等作用，并參與調(diào)節(jié)情感、認(rèn)知、情緒等生理活動的調(diào)節(jié)。同時5-HT的表達(dá)降低也是抑郁癥發(fā)病的重要生物學(xué)基礎(chǔ)之一。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清的5-HT 含量降低，這與大鼠的肝郁，情志不暢的狀態(tài)相符；鐵皮石斛益消方可使模型大鼠的5-HT 含量恢復(fù)至正常水平，使大鼠的精神狀態(tài)得到改善。提示鐵皮石斛益消方改善FD 模型大鼠的作用機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有關(guān)，表現(xiàn)為血清5-HT 含量的增加，改善了模型大鼠精神狀態(tài)，自主活動和探索能力增加，從而促進(jìn)胃腸道運動。鐵皮石斛益消方可以通過調(diào)節(jié)這些腦腸肽的水平，進(jìn)而改善FD 大鼠的胃腸道功能。

綜上所述，鐵皮石斛益消方改善肝胃不和型FD 大鼠的作用機(jī)制與雙向調(diào)節(jié)胃腸激素有關(guān)，表現(xiàn)為增加模型大鼠血清MTL 含量，下調(diào)血清VIP 水平，并通過促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 的釋放，促進(jìn)模型大鼠的胃排空及小腸推進(jìn)，增加小腸的吸收能力，最終改善胃腸道動力障礙。