李慕白 張 巖 王 蔚 劉 麗 吳效科

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種臨床常見的內分泌紊亂性疾病，好發(fā)于育齡期女性，且對女性的生活、工作以及心理健康有重大影響。該疾病臨床表現(xiàn)以月經(jīng)失調、脂代謝異常和高雄激素血癥為主。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，各國各地區(qū)PCOS的臨床表現(xiàn)具有高度的異質性，發(fā)生率約為8.7%～17.8%[1]。雖然異質性較高，但由于PCOS會引起患病女性卵巢形態(tài)改變，故其對于女性生殖功能的損害是不可避免的。對此有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者子宮內膜蛋白質組的差異是其子宮內膜容受性降低和生育能力下降的重要原因[2]。本研究即從基因層面采用生物信息學技術比較PCOS患者子宮內膜與健康人子宮內膜差異表達基因，并對關鍵基因的生物學功能以及所影響的信號通路進行探討，以期為臨床修復PCOS子宮內膜損傷提供靶向治療新位點。

對象與方法

1.研究對象：從2019年4～9月于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院婦科一科門診就診患者中挑選符合標準的PCOS患者3例(D組)，另招募健康女性3例(T組)。本研究納入標準：(1)女性年齡18～35歲。(2)育齡期女性。(3)排除其他疾病病史。(4)符合2003年國際鹿特丹診斷標準[①稀發(fā)排卵或無排卵；②高雄激素的臨床表現(xiàn)和(或)高雄激素血癥生化特征；③卵巢多囊改變：婦科盆腔超聲檢查提示一側或雙側卵巢直徑2～9mm的卵泡≥12個，和(或)卵巢體積≥10ml。上述3項中符合2項，并排除其他引起高雄激素血癥疾病者,如先天性腎上腺皮質增生、分泌雄激素的腫瘤、庫欣綜合征等即可確定診斷]。(5)了解本研究程序并簽署本研究知情同意書者。排除標準：①患有肝腎功能異常、心血管系統(tǒng)及其他內分泌代謝紊亂性疾??；②3個月內曾服用激素類藥物；③妊娠、哺乳期女性及精神疾病患者；④合并心血管、腦血管、肝臟、腎臟和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病；⑤近期參加過其他藥物臨床試驗的患者。正常對照者年齡、體重等相近,差異無統(tǒng)計學意義。本研究經(jīng)過黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(批準編號：HZYLLKY201901201)。

2.子宮內膜的提取及差異表達基因的篩選：所有入選女性均于月經(jīng)周期第7～10天內行宮腔鏡檢查術及部分子宮內膜診刮術。子宮內膜樣本經(jīng)NanoDrop ND-2000(美國Thermo Scientific公司)定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(美國Agilent Technologies公司)檢測RNA完整性。質檢合格后，將總RNA反轉錄成雙鏈cDNA，并合成用cyanine-3-CTP(Cy3)標記的cRNA。標記好的cRNA和芯片雜交洗脫后利用Agilent Scanner G2505C(美國Agilent Technologies公司)掃描得到原始圖像。采用Feature Extraction軟件(version10.7.1.1, 美國Agilent Technologies公司)處理原圖像提取原始數(shù)據(jù)。利用GeneSpring GX軟件(wersion14.9, 美國Agilent Technologies公司)對原始數(shù)據(jù)進行質檢標準化。根據(jù)t檢驗的P值和倍數(shù)變化值進行差異基因篩選，篩選標準為上調或者下調倍數(shù)變化值≥2.0且P<0.05。

3.基因功能及信號通路分析：采用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫對篩選出來的差異基因進行GO富集分析和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome)信號通路分析，同時繪制基因本體論氣泡圖。利用KEGG數(shù)據(jù)對差異基因進行通路分析，并利用超幾何算法計算每個通路中差異基因富集的顯著性，顯著性富集的篩選標準為P<0.01。

4.蛋白相互作用網(wǎng)絡的構建及基因編碼蛋白的亞細胞定位分析：將篩選出的差異基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，得到一個蛋白質相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction, PPI)圖。從中挑選出關鍵基因并利用PMLPR方法進行蛋白質亞細胞定位。

結 果

1.數(shù)據(jù)預處理：由于原始數(shù)據(jù)可能存在缺失值,基因對應多個探針等情況，故對各個樣本的芯片進行預處理，繪制預處理前后芯片對比圖(圖1)。

圖1 預處理前后樣本質量箱式對比圖

2.差異基因分布情況：按照差異篩選標準，共篩選出230個差異表達基因。對差異篩選結果進行火山圖繪制以確定差異基因分布情況(圖2)。

圖2 篩選差異基因分布情況

3.GO富集及KEGG信號通路分析：利用GO數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO功能富集分析。主要包含3大類，即生物學工程(biological process, BP)、細胞組分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)。GO富集分析結果顯示，其中BP中P<0.05的條目共計148條；CC中P<0.05的條目共計30條；MF中P<0.05的條目共計46條，主要包括參與蛋白輕、中鏈的結合，影響微管運動活性。對GO富集分析結果中各類P值最小的前10個條目繪制條形圖(圖3)。KEGG分析結果發(fā)現(xiàn)P<0.05的通路共計13條(圖4)。

圖3 GO富集分析結果條形圖

4.蛋白相互作用分析及關鍵基因篩選：對所有篩選出的差異表達基因進行PPI構建并聚類(圖5)。綜合上述分析結果，從中篩選出6個與PCOS臨床研究相關且差異表達較為顯著的6個基因分別為CACNA1C、LAMB3、CCND2、PLCB4、IL7、NTF3。上述關鍵基因分子功能主要為影響蛋白結合、細胞分裂、層黏連蛋白復合體等。生物學過程主要參與組織器官生長發(fā)育、鈣離子通道調節(jié)、信號轉導等。主要信號通路富集于胰島素分泌、促性腺激素信號通路、PI3K/AKT信號通路等。其中CACNA1C、LAMB3、CCND2表達上調，剩余3個在D組表達均下調(表1)。

表1 關鍵基因相關數(shù)值

圖5 差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡

5.差異表達基因編碼蛋白的亞細胞定位分析：利用PMLPR，檢索條件為“Human”物種，分別輸入6個關鍵基因，結果顯示上述基因中除CCND2基因編碼蛋白亞細胞大概率定位于細胞核外，余下基因編碼蛋白位置處于細胞膜的可能性較大。

討 論

PCOS作為一種激素內環(huán)境紊亂性疾病，主要引起生殖功能障礙和糖代謝異常。近年來，PCOS發(fā)生率逐年增加，但其發(fā)病機制仍不清楚。而遺傳因素是導致PCOS發(fā)病的主要因素之一，這一觀點受到了研究者的廣泛認可。因此，從基因角度挖掘PCOS病情變化以及臨床治療已成為一條全新的臨床思路。有研究者采用全基因組關聯(lián)研究(GWAS)方法來確定常見疾病的遺傳因素，結果發(fā)現(xiàn)，中國女性進行的兩次GWAS中發(fā)現(xiàn)11個位點與PCOS發(fā)病風險密切相關[3]。另外，有研究結果表明，與脂質和類固醇合成相關的低甲基化基因能促進類固醇激素(包括雄激素)的合成，從而解釋PCOS高雄激素血癥的機制[4]。也有研究者研究早期胰島素信號轉導與異常轉化生長因子β(TGF-β)調節(jié)的組織纖維化的關系中發(fā)現(xiàn)，基因表達暗示了TGF小分子配體調節(jié)纖維化在PCOS-肥胖協(xié)同胰島素抵抗和運動反應的改變[5]。

由于PCOS是一種婦科內分泌疾病，故對其代謝紊亂的基因探索一直是研究重點，而對于女性生殖系統(tǒng)的基因探索則相對較少。有研究者觀察PCOS大鼠模型發(fā)現(xiàn)卵巢出現(xiàn)大量閉鎖卵泡和囊性擴張，顆粒細胞層減少，卵泡細胞層增厚，濾泡膜細胞增生[6]。卵巢的形態(tài)學改變影響其正常生理功能，導致無成熟卵泡形成甚至無排卵，而子宮內膜長期受雌激素影響，正常的內膜周期發(fā)生紊亂，子宮內膜呈不同程度的增殖性改變甚至發(fā)展成為子宮內膜癌[7]。本研究為了明確PCOS患者子宮內膜基因表達變化情況，采集PCOS患者及健康人部分增殖期子宮內膜各3例，利用當前先進分子生物學技術，篩選出有統(tǒng)計學意義的230個差異表達基因，并對其進行了功能富集和信號通路分析。后利用蛋白相互作用表達網(wǎng)絡挑選出6個與PCOS臨床研究密切相關且差異較為顯著的基因，其中在D組中CACNA1C、LAMB3、CCND2表達上調，PLCB4、IL7、NTF3表達下調。這些差異表達的基因蛋白產(chǎn)物主要位于細胞核和細胞膜上。上述基因分子功能主要為蛋白結合、細胞分裂、層粘連蛋白復合體等。生物學過程主要富集于組織器官生長發(fā)育、鈣離子通道調節(jié)、信號轉導等，這些基因的發(fā)現(xiàn)可能為PCOS患者子宮內膜的修復提供新的臨床靶點。

CACNA1C基因位于人12號染色體上，即L-型鈣離子通道α1C亞基，其生物學功能是對人體內鈣離子通道的調節(jié)，并參與了胰島素分泌信號通路。該基因是一種編碼電壓門控鈣通道的精神疾病風險基因，其轉錄譜非常復雜，最新被鑒定發(fā)現(xiàn)的就有38個外顯子和241個轉錄本[8]。該基因在PCOS方面暫無相關報道。但在子宮內膜方面，Qiao等[9]對子宮內膜癌突變基因進行了篩選，發(fā)現(xiàn)KIAA1109、CACNA1C、BSN、AKAP13、CELSR2、HELZ2等基因的突變較為突出。這表明CACNA1C基因的表達對于人體子宮內膜的病變有一定影響,這可能是引發(fā)少數(shù)PCOS患者隨著病情的發(fā)展逐漸出現(xiàn)子宮內膜息肉甚至不典型增生的重要原因。

LAMB3、CCND2、IL7、NTF3都參與了PI3K/AKT信號通路，PI3K/AKT信號通路是目前研究PCOS的重點通路，在最新研究中，有研究者造模PCOS胰島素抵抗大鼠，后予以黃連素喂養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)黃連素能有效降低大鼠模型系統(tǒng)中的PCOS胰島素抵抗值，這一結果的產(chǎn)生則與400mg/kg的黃連素治療能對PI3K/AKT信號通路起激活作用密切相關[10]。而對于該通路和子宮內膜之間的聯(lián)系，也有研究者利用PI3K/AKT活性通路的特異性抑制劑作用于Ishikawa細胞，來研究其對細胞中AKT和SGK1激酶活性的影響，Ishikawa細胞是一種特征清晰的子宮內膜細胞系，代表接受性子宮內膜，結果發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT活性通路的特異性抑制劑能夠針對性治療子宮內膜上皮細胞病變[11]。LAMB3名為層粘連蛋白β3亞單位，是編碼LM-332的3個亞單位之一，當前對于該基因的研究是發(fā)現(xiàn)該基因的表達與某些類型的癌癥的擴散和轉移能力有關，例如胰腺癌，有研究者發(fā)現(xiàn)LAMB3在胰腺癌患者體內過表達，而通過抑制LAMB3可以消除PI3K/AKT信號通路激活的致瘤結果，包括細胞體外增殖、侵襲和遷移以及體內腫瘤生長等[12]。

CCND2屬于CCNDs家族，該家族由MOTOKURA等在對于甲狀腺癌的研究中被首次分離出來，共存在CCND1、CCND2和CCND3 3個亞型。目前，對于該基因的婦科研究重點在于卵巢癌方面，Chang等[13]通過實驗發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA HOTAIR在卵巢癌組織和細胞系中的表達顯著高于對照組，同時負向調節(jié)miR-206表達，而CCND1和CCND2作為miR-206的下游目標，與HOTAIR形成了正向調控關系，并通過功能分析，表明在卵巢癌中同時過度表達CCND1或CCND2，可以挽救miR-206的抗癌作用，從而有效卵巢癌細胞的增殖和轉移。CCND2作為促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)的下游因子之一，主要在卵巢顆粒細胞中進行表達，并且在卵泡的發(fā)育過程中促進顆粒細胞增殖[14]。作為卵巢重要組成部分之一的顆粒細胞，在卵泡發(fā)育成熟及排卵的一系列過稱中起著極其重要的作用，并且顆粒細胞功能的異常也是引起PCOS的主要病理生理基礎[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CCND2作為LAMB3通路下游基因之一，在肝細胞癌上的治療上，對于獼猴桃根提取物(ERAC)的響應相同[16]。由此推測在修復PCOS子宮內膜損傷方面，可以通過抑制LAMB3基因在PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用防止癌變的同時，也會抑制下游基因CCND2的過表達，使其可以有效治療PCOS患者卵巢形態(tài)變化，恢復正常排卵功能，從而改善雌激素分泌情況，修復子宮內膜損傷。

PLCB4作為一種磷脂酶位于人20號染色體p12區(qū)域，磷脂酶C(phospholipase C, PLC)是一種膜相關酶，調節(jié)細胞的運動、生長、轉化和分化等多種行為。PLC參與腫瘤的遷移、侵襲和耐藥[17]。Li等[18]為了探討脂質分解代謝相關基因在胃腸道間質瘤中的意義，鑒定了與腫瘤進展相關的復制和差異上調的PLCB4基因，結果證明與正常組織比較，不同風險水平的腫瘤中PLCB4 mRNA豐度均顯著增加，且與免疫表達水平密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)PLCB4除了參與癌癥細胞通路外，還參與調控促性腺激素信號通路以及炎性反應的信號通路，推斷該基因表達的下調，可能與PCOS患者子宮內膜存在慢性炎癥病理反應相關。

綜上所述，本研究通過生物學信息技術，從基因層面對PCOS子宮內膜差異基因進行了深入分析，獲得了可信的基因數(shù)據(jù)。挑選出來的6個關鍵基因CACNA1C、LAMB3、CCND2、PLCB4、IL7、NTF3由于參與多條PCOS生殖內分泌相關信號通路，且具有重要的代謝調節(jié)作用，可以為臨床上延緩PCOS子宮內膜損傷甚至病變發(fā)展進程提供新的基因靶向治療參考。