靳曉杰 ，王菲，毛建軍，王燕如，關(guān)瑞寧，劉東玲，魏本君，李亞玲，張利英，張志明，劉永琦，4

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的傳染性疾病對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-4]。中醫(yī)藥在該病毒引起的疾病預(yù)防、治療和康復(fù)的全過(guò)程中發(fā)揮了舉足輕重的作用[5-8]。甘肅省注重發(fā)揮中醫(yī)優(yōu)勢(shì)，堅(jiān)持“一患一方”“濕邪貫穿全程”“慎用苦寒”“早用中醫(yī)，截?cái)嗖?shì)”“立足肺脾、祛濕為先”等理念，積極采用中醫(yī)全程參與防治。甘肅省專(zhuān)家組總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，形成了“甘肅方劑”系列方，涵蓋預(yù)防、治療、康復(fù)各階段。其中，具有益氣固表、扶正辟瘟功效的扶正避瘟方推薦用于普通人群、醫(yī)務(wù)人員、監(jiān)測(cè)點(diǎn)工作人員和密切接觸者的預(yù)防用藥[9-11]。《全國(guó)各省區(qū)中醫(yī)藥治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的診療方案分析》顯示，方中蒼術(shù)、防風(fēng)、黃芪、連翹用藥頻次高[12]。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（computer aided drug design，CADD）中的同源模建、分子對(duì)接、結(jié)合模式分析等技術(shù)可以從相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)或基因序列出發(fā)，在得到相應(yīng)靶點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)特征的基礎(chǔ)上，對(duì)中藥化合物與靶點(diǎn)之間的相互作用方式及親和力進(jìn)行基于力場(chǎng)或知識(shí)的預(yù)測(cè)，從而虛擬篩選得到潛在活性成分。研究表明，SARS-CoV-2 利用高度糖基化的同源三聚體S 蛋白與人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合進(jìn)入宿主細(xì)胞[13-14]。該蛋白是介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在與ACE2 發(fā)生結(jié)合前處于不可達(dá)狀態(tài)的預(yù)融狀態(tài)[15]。預(yù)防方的作用期是病毒進(jìn)入人體之前，ACE2 和SARS-CoV-2 S 蛋白均處于各自的穩(wěn)定構(gòu)象，故本研究選擇SARS-CoV-2 S 蛋白預(yù)融狀態(tài)的受體結(jié)合區(qū)域（receptor binding region，RBD）及其受體ACE2 的結(jié)構(gòu)作為目標(biāo)靶點(diǎn)，采用同源模建、分子對(duì)接方法探尋扶正避瘟方對(duì)病毒起直接阻斷作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及相互作用模式。在此基礎(chǔ)上，為分析阻斷活性化合物是否會(huì)影響ACE2 的正常功能而產(chǎn)生不良反應(yīng)，本研究對(duì)潛在阻斷成分與ACE2 的活性位點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接和深入的相互作用模式分析，并通過(guò)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)-KEGG 通路分析-分子對(duì)接驗(yàn)證的系統(tǒng)研究方法分析方中非阻斷藥味通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體間接抵御病毒的分子機(jī)制，為該方的進(jìn)一步優(yōu)化及開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 虛擬篩選

1.1.1 配體準(zhǔn)備

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）[16]、ETCM[17]和TCMID[18]數(shù)據(jù)庫(kù)，以“蒼術(shù)”“白術(shù)”“防風(fēng)”“荷葉”“黃芪”“連翹”“生姜”為關(guān)鍵詞檢索扶正避瘟方化學(xué)成分結(jié)構(gòu)，共收集到化合物871 個(gè)。

1.1.2 晶體結(jié)構(gòu)選擇及同源模建

SARS-CoV-2 S 蛋白和SARS-CoV S 蛋白序列比對(duì)結(jié)果（見(jiàn)圖1）顯示，二者一致性為76.47%，符合同源模建的條件。以SARS-CoV S 蛋白為模板（PDB ID：6ACD）[19]在Swissmodel 平臺(tái)[20]完成同源模建，獲得 SARS-CoV-2 的 RBD 結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)和SARS-CoV-2 S 蛋白與ACE2 結(jié)構(gòu)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中SARS-CoV-2 RBD 結(jié)構(gòu)[13]高度相似（Pymol 中RMSD計(jì)算值為1.235 ?）。

1.1.3 分子對(duì)接

使用Glide 的標(biāo)準(zhǔn)精度方法（standard precision，SP）進(jìn)行分子對(duì)接。下載蛋白結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，SARS-CoV-2 結(jié)合位點(diǎn)的確定是基于同源模建后的結(jié)構(gòu)與復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：2AJF）[17]在Pymol中疊合得到，對(duì)SARS-CoV S（PDB ID：6ACD）選擇與復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：2AJF）疊合后S 蛋白結(jié)合區(qū)域周?chē)? ? 以內(nèi)的殘基作為活性位點(diǎn)產(chǎn)生Grid 文件，對(duì)ACE2（PDB ID：1R42）[15]蛋白選擇其結(jié)合S 蛋白的活性位點(diǎn)產(chǎn)生Grid 文件。對(duì)“1.1.1”項(xiàng)下收集的小分子結(jié)構(gòu)用LigPrep2.3 進(jìn)行處理，運(yùn)用MMFFs 力場(chǎng)得到相應(yīng)的低能構(gòu)象。Epik2.0 以pH＝7.0±2.0 為條件分配電離狀態(tài)并進(jìn)行對(duì)接計(jì)算。

圖1 SARS-CoV-2 S 蛋白與SARS-CoV S 蛋白序列比對(duì)

1.2 中藥化合物靶點(diǎn)反向預(yù)測(cè)

中藥化合物與特定靶點(diǎn)結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)靶點(diǎn)相應(yīng)的生物學(xué)功能，使藥物發(fā)揮治療作用。依據(jù)分子相似性原理對(duì)化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究采用SwissTargetPrediction 在線分析工具（http://www.swisstargetprediction.ch），預(yù)測(cè)扶正避瘟方中非直接阻斷藥味的作用靶點(diǎn)，并將概率值≥0.5 的生物大分子作為該成分的潛在有效靶點(diǎn)。先將符合Lipinski 規(guī)則的中藥化合物轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)的SMILES 格式，再將SMILES 格式文件導(dǎo)入SwissTargetPrediction，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”。

1.3 生物功能和通路富集分析

生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID（https://www.omicshare.com/tools/）為大規(guī)?；蚧虻鞍赘患ぞ撸峁┫到y(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，能夠找出最顯著富集的生物學(xué)注釋[21]。將白術(shù)預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，Select identifier 設(shè)置為official gene symbol，List type 設(shè)置為gene list，限定物種為homo sapiens，閾值為P＜0.05，進(jìn)行KEGG 通路分析。利用Image GP（http://www.ehbio.com/ImageGP/）工具在線繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)阻斷成分篩選結(jié)果

通常打分值≤-5 的化合物被認(rèn)為與靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的相互作用，多靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果（見(jiàn)表1）顯示，扶正避瘟方中對(duì)SARS-CoV-2 蛋白與ACE2 的結(jié)合具有潛在阻斷作用的成分?jǐn)?shù)量較多的藥味是連翹、生姜、荷葉和黃芪，表明方中這4 味藥對(duì)SARS-CoV-2 感染具有針對(duì)性的阻斷作用，其中連翹、荷葉中的連翹脂苷A、(-)-兒茶素、熊竹素等單體成分具有現(xiàn)代藥物研究基礎(chǔ)，可作為單一成分用于預(yù)防SARS-CoV-2 感染的研究與開(kāi)發(fā)，而白術(shù)對(duì)病毒感染不具有針對(duì)性的阻斷作用。該結(jié)果與相應(yīng)藥味的藥性及作用較為相符：連翹疏風(fēng)散熱，防止邪犯衛(wèi)表；荷葉性涼，清涼解熱可利濕；生姜入肺經(jīng)，解表散寒、溫肺止咳，阻止毒氣入里；黃芪常用于補(bǔ)氣升陽(yáng)、增強(qiáng)正氣以提高自身免疫力。本研究發(fā)現(xiàn)黃芪中某些成分也具有直接阻斷病毒的作用。該結(jié)果初步闡明了扶正避瘟方的“避瘟”物質(zhì)基礎(chǔ)。白術(shù)為補(bǔ)氣藥，功效健脾益氣，推測(cè)其主要通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮“扶正”作用。

表1 扶正避瘟方中藥成分對(duì)接數(shù)量（打分值≤-5）

2.2 各藥味對(duì)多靶點(diǎn)的選擇性分析

由分子對(duì)接結(jié)果可知，扶正避瘟方各藥味對(duì)不同靶點(diǎn)具有一定的選擇性。整體而言，方中諸藥對(duì)S 蛋白阻斷力更強(qiáng)，且對(duì)不同冠狀病毒均有作用。連翹、荷葉顯示了較強(qiáng)的雙向阻斷能力，而黃芪、生姜對(duì)S蛋白的選擇性更突出。結(jié)構(gòu)比對(duì)表明，SARS-CoV-2和SARS-CoV的RBD結(jié)構(gòu)高度相似，但分子對(duì)接結(jié)果顯示扶正避瘟方中不同藥味對(duì)二者具有選擇性，這為中藥藥味的精準(zhǔn)選擇提供了依據(jù)（見(jiàn)圖2）。由圖2可知，扶正避瘟方整體對(duì)2種病毒的阻斷作用差異不大，而方中不同藥味對(duì)不同病毒有一定的選擇性，該結(jié)果在荷葉和生姜之間尤為突出。荷葉20個(gè)潛在阻斷成分中，13個(gè)對(duì)SARS-CoV 有針對(duì)性阻斷作用，7個(gè)對(duì)SARS-CoV-2有作用。生姜打分值高的12個(gè)成分中，11個(gè)對(duì)SARS-CoV-2有針對(duì)性阻斷作用，而對(duì)SARS-CoV 有作用的只有1個(gè)。這一結(jié)果表明，荷葉對(duì)SARS-CoV 的選擇性高于SARS-CoV-2，生姜對(duì)SARS-CoV-2的選擇性高于SARS-CoV。

2.3 各靶點(diǎn)阻斷成分作用機(jī)制分析

ACE2對(duì)接結(jié)果顯示其潛在阻斷化合物的結(jié)合位點(diǎn)分為內(nèi)外兩區(qū)域，外側(cè)（圖3A）是結(jié)合化合物比較多的區(qū)域，該位點(diǎn)共有16個(gè)化合物結(jié)合，占66.67%。以打分值≤-5和口服生物利用度（OB）＞30%為依據(jù)從與2個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的化合物中分別挑選出MOL007214（白矢車(chē)菊苷元）、MOL000239（熊竹素）用于ACE2 阻斷成分結(jié)合模式分析（見(jiàn)圖3A、圖3B）。MOL003331（連翹脂苷A）、MOL000239（熊竹素）、MOL000096（(-)-兒茶素）與SARS-CoV-2、SARS-CoV結(jié)合模式圖見(jiàn)圖3C～圖3F。

圖2 扶正避瘟方各藥味與SARS-CoV-2和SARS-CoV 靶向作用（打分值≤-5）成分對(duì)比分析

圖3 代表化合物與ACE2、SARS-CoV-2、SARS-CoV 結(jié)合模式圖

白矢車(chē)菊苷元結(jié)合在ACE2的外側(cè)（見(jiàn)圖3A），其母核為黃烷-3,4-二醇類(lèi)結(jié)構(gòu)，A 環(huán)7位的羥基與Asp38形成氫鍵相互作用，A 環(huán)5位羥基、C環(huán)4位羥基同時(shí)與殘基Glu 35形成氫鍵相互作用，同時(shí)B環(huán)上3、4位的羥基也與Glu 75存在氫鍵相互作用，殘基Phe72、Leu 39以疏水作用力作用在化合物上，這些作用力使化合物穩(wěn)定結(jié)合于ACE2蛋白。

熊竹素垂直嵌入ACE2 的疏水空腔內(nèi)（見(jiàn)圖3B），與Tyr 385、Phe40、Phe 390、Trp 69等殘基形成疏水相互作用。該化合物母核結(jié)構(gòu)為黃酮類(lèi)，其A 環(huán)上的6位羥基與Arg 393形成氫鍵相互作用，周?chē)臉O性殘基和離子型殘基也進(jìn)一步穩(wěn)定了化合物的結(jié)合。

生姜活性成分(+)-順式香芹酚與ACE2結(jié)合時(shí)其活性位點(diǎn)位于蛋白內(nèi)側(cè)空腔，而ACE2與S蛋白的預(yù)融構(gòu)象的結(jié)合位點(diǎn)則位于外側(cè)。S蛋白亞穩(wěn)定狀態(tài)預(yù)融構(gòu)象為了與宿主細(xì)胞ACE2 受體結(jié)合，S1 亞基RBD會(huì)經(jīng)歷鉸鏈?zhǔn)降臉?gòu)象變化，這些變化能夠誘導(dǎo)ACE2暴露受體結(jié)合位點(diǎn)。ACE2 與S 蛋白的結(jié)合主要發(fā)生在外側(cè)殘基，而復(fù)合物的對(duì)接結(jié)果[22]顯示，中藥成分的結(jié)合均在外側(cè)。本研究對(duì)ACE2 單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接結(jié)果顯示，有部分打分較好的化合物其作用區(qū)域并不在外側(cè)，表明中藥（如生姜）的成分在ACE2 與病毒S蛋白結(jié)合前后的作用位點(diǎn)不同。部分化合物與ACE2單體結(jié)合時(shí)，其位點(diǎn)處于內(nèi)側(cè)，導(dǎo)致阻斷能力下降，但對(duì)ACE2 與S 蛋白形成的復(fù)合物，這些成分可能因與S 蛋白形成復(fù)合物而暴露的ACE2 外側(cè)的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生阻斷活性。

連翹中連翹脂苷A 與2 種S 蛋白的結(jié)合模式相似，主要集中在RBD 與ACE2 的結(jié)合界面上[13]。由圖3C可知，連翹脂苷A苯環(huán)上的羥基與殘基Phe 490、Asn 501、Tyr 495 形成氫鍵相互作用，2 個(gè)六元環(huán)上羥基分別與Tyr 453、Lys 417 形成氫鍵相互作用，化合物支鏈的醚氧原子與Tyr 453 亦形成氫鍵相互作用，周?chē)腖eu 492、Tyr 490、Phe 497、Leu 455 等殘基表現(xiàn)為疏水性質(zhì)，周?chē)臉O性殘基和離子型殘基進(jìn)一步穩(wěn)定了化合物-蛋白結(jié)構(gòu)。熊竹素苯環(huán)（A 環(huán)）與SARS-CoV-2 上的Tyr 505 產(chǎn)生π-π 堆積作用，且環(huán)上4 位的羥基與殘基Gly 496 形成氫鍵相互作用，另一個(gè)環(huán)與殘基Arg 403 表現(xiàn)為陽(yáng)離子-π 作用，殘基Ile 418、Tyr 453、Tyr 496、Phe 497 通過(guò)疏水作用穩(wěn)定了化合物與蛋白的結(jié)合（見(jiàn)圖3D）。連翹脂苷A 與SARS-CoV 蛋白間的主要作用力是氫鍵和疏水作用力（見(jiàn)圖3E）。(-)-兒茶素與SARS-CoV 結(jié)合時(shí)，其A環(huán)上7 位羥基、B 環(huán)3,4 位羥基及C 環(huán)3 位羥基分別與殘基Tyr 491、Asp 393、Tyr 440 形成氫鍵相互作用（見(jiàn)圖3F）。

通過(guò)結(jié)合模式分析可知，在化合物結(jié)合區(qū)域SARS-CoV-2 與SARS-CoV 具有很多相同的熱點(diǎn)殘基，包括Tyr 453、Leu 492、Tyr 495、Phe 497、Tyr 505等，但SARS-CoV-2 中有部分熱點(diǎn)氨基酸（Leu 455、Phe 490、Gln 493、Glu 406）發(fā)生了突變，這些突變可能是中藥成分對(duì)2 種病毒S 蛋白產(chǎn)生選擇性作用的主要原因。

2.4 潛在活性化合物對(duì)腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)的影響評(píng)估

ACE2 廣泛存在于人體各部位，主要分布在腎、心、肺、肝、腸等器官[23]，通過(guò)腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)起到平衡局部腎臟穩(wěn)態(tài)[24]，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[25]、減輕動(dòng)脈粥樣硬化[25]、預(yù)防肺血管收縮和肺纖維化等作用[1]。因此，對(duì)ACE2 正常功能的影響將導(dǎo)致潛在的危險(xiǎn)。為探討潛在阻斷成分是否會(huì)干擾ACE2 的正常功能，本研究對(duì)將潛在阻斷化合物與ACE2 抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)只有2個(gè)化合物的打分值比ACE2 抑制劑MLN1706 的打分值高，分別為漢黃芩苷（MOL013068）和連翹苷G（MOL003338）。與該位點(diǎn)結(jié)合強(qiáng)的化合物進(jìn)入人體后可能占據(jù)ACE2 活性位點(diǎn)，從而影響ACE2 的催化功能。但有研究表明，中藥起效時(shí)體內(nèi)各化學(xué)成分實(shí)際血藥濃度可能比化學(xué)藥的最小有效血藥濃度更低，單一中藥成分進(jìn)入體內(nèi)激動(dòng)相關(guān)靶點(diǎn)并引起相應(yīng)藥理效應(yīng)的可能性較小，通常需要多種化學(xué)成分疊加作用于相同靶點(diǎn)才能產(chǎn)生相應(yīng)作用[26]。且漢黃芩苷和連翹苷G 均為苷類(lèi)化合物，OB 值分別為7.07%、3.32%[16]，均較低，不會(huì)直接影響ACE2 在體內(nèi)的正常功能，對(duì)正常人和患有基礎(chǔ)性疾病人群尤其高血壓患者較為安全[1，27]。

2.5 非阻斷藥味機(jī)體調(diào)控的分子機(jī)制

分子對(duì)接結(jié)果顯示，白術(shù)缺乏阻斷病毒S 蛋白與ACE2 的物質(zhì)基礎(chǔ)，表明其直接阻斷病毒的能力不足。本研究通過(guò)反向靶點(diǎn)預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)白術(shù)化合物作用靶點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行生物過(guò)程和通路富集分析，利用分子對(duì)接驗(yàn)證白術(shù)化合物與潛在靶點(diǎn)的親和力。

依據(jù)Lipinski 規(guī)則篩選得到白術(shù)化合物41 個(gè)，對(duì)其進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，保留概率值≥0.5 的24 個(gè)靶點(diǎn)。將24 個(gè)靶點(diǎn)基因名稱(chēng)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行生物過(guò)程和通路富集分析[28]。生物過(guò)程富集結(jié)果（P＜0.05）見(jiàn)圖4，白術(shù)成分可能通過(guò)one-carbon metabolic process（一碳代謝過(guò)程）、G-protein coupled glutamate receptor signaling pathway（代謝性G 蛋白-偶聯(lián)谷氨酸受體調(diào)控）等生物過(guò)程參與機(jī)體功能調(diào)節(jié)。通路富集結(jié)果（P＜0.05）見(jiàn)圖5，白術(shù)化合物靶點(diǎn)參與的通路包括Retrograde endocannabinoid signaling（逆行性內(nèi)源性大麻素信號(hào)）、Neuroactive ligand-receptor interaction（神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路）、Glutamatergic synapse（谷氨酸能突觸）等。

藥物成功上市的靶點(diǎn)在成藥性和機(jī)體調(diào)控中的關(guān)鍵地位是經(jīng)過(guò)大量實(shí)踐證實(shí)的，本研究預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中有對(duì)應(yīng)上市藥物且臨床試驗(yàn)成功的靶點(diǎn)共7 個(gè)，經(jīng)查詢有4 個(gè)可獲得晶體結(jié)構(gòu)，分別為大麻素受體2（cannabinoid receptor 2，CB2）、碳酸酐酶12（carbonic anhydrase Ⅻ，CA12）、離子型谷氨酸受體蛋白（紅藻氨酸鹽型）1（glutamate receptor ionotropic kainate 1，GRIK1）、α 過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體（proliferator-activated receptor alpha，PPARA）。將這4個(gè)個(gè)靶點(diǎn)與白術(shù)術(shù)41 個(gè)化合物進(jìn)行分子對(duì)對(duì)接（PDBID分別為CB2：6PT0[29]、CCA12：1JDOO[30]、GRIK11：4MMF3[31]、PPARRA：4IC4[32]），結(jié)果CB2、CA12、GRIKK1、PPPAARA 與各自自靶點(diǎn)有相互互作用的比例例分別為8/133、4/99、3/10、9/116，總比例為為24/48。

圖4 白術(shù)成分靶靶點(diǎn)GO 富集分析析

圖5 白術(shù)成分靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

分子對(duì)接結(jié)結(jié)果顯示，白白術(shù)與CB2打分值＜-5的成分有30 個(gè)，其中打分值值＜-8 的有3 個(gè)，分別別為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（OOB：68.11%%）、蒼術(shù)酮（OB：41.10%%）和茅茅蒼術(shù)醇（OOB：38.59%%），表明這33 種化合物與與免疫靶靶點(diǎn)CB2有有較強(qiáng)的潛在結(jié)結(jié)合能力。CCB2 顯著表達(dá)達(dá)于免疫疫系統(tǒng)如B淋淋巴細(xì)胞，具具有關(guān)鍵的免疫疫調(diào)控功能[333]。其主要通過(guò)絲裂原活化蛋蛋白激酶（miitogen activaated prootein kinase，MAPK）信信號(hào)通路中的的3 個(gè)主要亞亞族發(fā)揮揮調(diào)控作用，，包括細(xì)胞外外調(diào)節(jié)蛋白酶酶（extracelluular siggnal-regulatedd kinase，ERRK）、c-Jun氨基末端激激酶（cc-Jun N-termminal kinase，JNK）和p338。研究表明明，CBB2 活化后，通通過(guò)激活Gii/o 釋放其β、、γ 亞單位，激活MAPK 通路路，促進(jìn)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度度升高，促進(jìn)進(jìn)β-內(nèi)啡肽釋放，從從而產(chǎn)生消炎炎鎮(zhèn)痛作用[344]；CB2 激活活后亦可可通過(guò)激活Rap1 逆轉(zhuǎn)作作用，抑制炎炎癥反應(yīng)[34]，對(duì)細(xì)胞間間黏附分子和和p-選擇素的的表達(dá)進(jìn)行抑抑制，進(jìn)而減減少巨噬噬細(xì)胞的黏附附和浸潤(rùn)[33]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，激活活CB2可可降低白細(xì)胞胞內(nèi)皮細(xì)胞相相互作用，以以進(jìn)一步防止止敗血癥癥中的炎癥損損傷[35]。本研研究對(duì)白術(shù)靶靶向CB2成成分的結(jié)結(jié)合模式分析析發(fā)現(xiàn)，其中中具有與CBB2 激動(dòng)劑相相似的結(jié)結(jié)合模式[29]，，表明白術(shù)可可能通過(guò)作用用于CB2激激活其免免疫調(diào)節(jié)功能能，從而間接接抵御病毒入入體。PPARAA可參與與胰高血糖素素（glucagonn signaling paathway）、環(huán)環(huán)磷酸腺腺苷（cAMPP）、脂肪細(xì)胞胞因子（adippocytokine）、非酒精性脂肪肝肝（non-alcohholic fatty lliver diseasee（NAAFLD）等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[36]，是高脂血癥[36]、高脂蛋蛋白血癥[36]、、高膽固醇和和二型糖尿病病[37]等基礎(chǔ)性性疾病的的治療靶點(diǎn)。基礎(chǔ)疾病患患者對(duì)SARS-CoV-2 更加加易感，，白術(shù)中有228 個(gè)成分與PPARA 打分分值＜-5，具具有潛在在的結(jié)合作用用，表明白術(shù)術(shù)成分具有通通過(guò)PPARAA調(diào)節(jié)基基礎(chǔ)性相關(guān)代代謝通路的作作用，從而對(duì)對(duì)上述基礎(chǔ)性性疾病產(chǎn)產(chǎn)生藥理活性性，扶正避溫溫方在預(yù)防病病毒的同時(shí)也也可兼顧顧相應(yīng)的基礎(chǔ)礎(chǔ)性疾病。

3 討討論

本本研究基于病病毒感染過(guò)程程的分子機(jī)制制，通過(guò)對(duì)病病毒和人人體的靶點(diǎn)進(jìn)進(jìn)行阻斷成分分的篩選，初初步得到扶正正避瘟方方“避瘟”的的分子依據(jù)，并對(duì)方中藥藥物對(duì)不同冠冠狀病毒毒發(fā)揮作用的的成分差異進(jìn)進(jìn)行了深入分分析，可為抗抗病毒中中藥的差異化化、精準(zhǔn)化使使用提供物質(zhì)質(zhì)基礎(chǔ)和方法法學(xué)參考考。

本本研究對(duì)靶點(diǎn)點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)選選擇時(shí)進(jìn)行了了充分考慮，SARSS-CoV-2 高度度糖基化的同同源三聚體S蛋白以亞穩(wěn)穩(wěn)定狀態(tài)態(tài)的預(yù)融合構(gòu)構(gòu)象存在，該該結(jié)構(gòu)發(fā)生構(gòu)構(gòu)象重排后與與宿主細(xì)細(xì)胞膜融合。由于S1亞亞基與宿主細(xì)細(xì)胞受體的結(jié)結(jié)合破壞壞了融合前三三聚體的穩(wěn)定定性，導(dǎo)致S1 亞基脫落，S2亞亞基過(guò)渡到高度度穩(wěn)定的融合合后構(gòu)象。為為了與宿主細(xì)細(xì)胞受體體結(jié)合，S1 RRBD 經(jīng)歷了類(lèi)類(lèi)似于鉸鏈的的構(gòu)象運(yùn)動(dòng)，這些運(yùn)運(yùn)動(dòng)可暫時(shí)隱隱藏或暴露受受體結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)。這2 種狀狀態(tài)被稱(chēng)稱(chēng)為“下”構(gòu)構(gòu)象和“上”構(gòu)象，其中中“下”對(duì)應(yīng)應(yīng)于受體體的結(jié)合屬于于不可達(dá)狀態(tài)態(tài)，“上”對(duì)對(duì)應(yīng)于受體可可達(dá)狀態(tài)態(tài)，而受體可可達(dá)狀態(tài)被認(rèn)認(rèn)為是不穩(wěn)定定的。該蛋白是在與與ACE2 結(jié)合合發(fā)生結(jié)合之之前，處于不不可達(dá)狀態(tài)的的預(yù)融狀狀態(tài)。因此，本研究選擇擇SARS-CoVV-2 S 蛋白預(yù)預(yù)融合構(gòu)構(gòu)象（“下”構(gòu)構(gòu)象）用于預(yù)防防方阻斷成分分的篩選[38]。同樣，，由于發(fā)生感感染前ACE22 尚未與S 蛋蛋白結(jié)合，故故對(duì)ACCE2 阻斷成分分篩選時(shí)，選選擇ACE2 單單體結(jié)構(gòu)。為為探討中中藥是否對(duì)高高度相似的病病毒蛋白具有有選擇性，本本研究設(shè)設(shè)計(jì)了SARSS-CoV S 蛋白白結(jié)構(gòu)的虛擬擬篩選，用于于對(duì)比分分析。

本研究結(jié)果基本符合相關(guān)藥味在方中的作用和相應(yīng)藥性，連翹、生姜、荷葉、黃芪對(duì)SARS-CoV-2感染具有針對(duì)性阻斷作用，分別有24、15、11、10個(gè)阻斷成分，而白術(shù)缺乏直接阻斷成分。選擇性分析顯示不同藥味對(duì)不同靶點(diǎn)具有針對(duì)性，荷葉對(duì)SARS-CoV 的選擇性高于 SARS-CoV-2，生姜對(duì)SARS-CoV-2 的選擇性高于SARS-CoV，而黃芪和連翹對(duì)2 種病毒的針對(duì)性成分?jǐn)?shù)量差異不大?！蹲C治準(zhǔn)繩.瘍醫(yī)》有“連翹黃芪湯”，連翹解毒涼血、散結(jié)消腫，黃芪益氣生血、托瘡生肌，二者配伍有解毒消腫、托瘡排膿之效。本研究表明，連翹、黃芪分別對(duì)ACE2、冠狀病毒S 蛋白具有較強(qiáng)針對(duì)性作用，可配合使用，增強(qiáng)抵御冠狀病毒療效。依據(jù)《既是食品又是藥品的物品名單》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51 號(hào)），荷葉、黃芪、生姜均為藥食同源中藥，其中荷葉、生姜既是食品又是藥品，黃芪屬于保健食品類(lèi)別。民間有“黃芪生姜湯”“荷葉老姜茶”等，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》記載了黃芪與荷葉相配的用法，表明這些藥味配伍具有一定的應(yīng)用基礎(chǔ)和合理性。根據(jù)研究結(jié)果，荷葉、生姜、黃芪配伍值得作為防治冠狀病毒感染的保健品或食療方進(jìn)一步研發(fā)。通過(guò)對(duì)白術(shù)中非直接阻斷成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行反向預(yù)測(cè)及通路分析可知，其主要通過(guò)逆行性內(nèi)源性大麻素信號(hào)等通路發(fā)生抑制炎癥作用，從而幫助機(jī)體抵御病毒。

扶正避瘟方中對(duì)SARS-CoV-2 具有潛在阻斷活性成分84 個(gè)，而分子對(duì)接結(jié)果顯示其中只有2 個(gè)化合物對(duì)ACE2 的催化位點(diǎn)具有潛在結(jié)合能力。中藥體內(nèi)單一化學(xué)成分激動(dòng)相關(guān)靶點(diǎn)并引起相應(yīng)藥理效應(yīng)的可能性較小，加之這2 個(gè)化合物口服生物利用度較低，表明該方在阻斷病毒同時(shí)不會(huì)擾亂由ACE2 參與調(diào)控的腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)而造成相應(yīng)副作用。

本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)驗(yàn)證了扶正避瘟方的有效性和安全性，并對(duì)非直接阻斷藥味白術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)性的預(yù)測(cè)，結(jié)果表明白術(shù)成分可能會(huì)激活CB2 等免疫靶點(diǎn)，間接調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，從而起到“扶正”作用。