高金霞 李秀元 ?，摤?范興君 谷紅梅 楊勇 靳革

【摘要】 目的：探討環(huán)狀RNA PVT1（circPVT1）在原發(fā)性非小細胞肺癌（NSCLC）患者組織和血液中的表達情況及其在NSCLC早期診斷的應(yīng)用價值。方法：選取本院收治的68例NSCLC患者作為病例組，另選取同期于本院進行體檢的68例正常人作為對照組。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測病例組的肺癌組織與癌旁正常組織及兩組血清circPVT1表達情況，分析circPVT1表達水平及其與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系，應(yīng)用ROC曲線分析circPVT1對于NSCLC早期診斷的應(yīng)用價值。結(jié)果：病例組肺癌組織circPVT1表達水平高于癌旁正常組織（P<0.05）。病例組血清circPVT1表達水平高于對照組（P<0.05）。不同性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、組織學(xué)分化程度的肺癌組織circPVT1表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），是否吸煙、不同腫瘤分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織circPVT1表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。組織circPVT1表達水平診斷NSCLC的ROC曲線下面積為0.805[P<0.001，95%CI（0.731，0.880）]。血清circPVT1表達水平診斷NSCLC的ROC曲線下面積為0.782[P<0.001，95%CI（0.704，0.860）]。結(jié)論：circPVT1在NSCLC組織和血清中的表達水平均明顯增高，腫瘤組織中circPVT1高表達與吸煙、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，circPVT1對于NSCLC具有一定的診斷價值。

【關(guān)鍵詞】 NSCLC circPVT1 ROC曲線

Study on the Expression Level and Diagnostic Value of circPVT1 in Primary Non-small Cell Lung Cancer/GAO Jinxia， LI Xiuyuan， NIU Yingying， FAN Xingjun， GU Hongmei， YANG Yong， JIN Ge. //Medical Innovation of China， 2021， 18（31）： 0-014

[Abstract] Objective： To investigate the expression of circular RNA PVT1 （circPVT1） in tissues and blood of patients with primary non-small cell lung cancer （NSCLC） and its application value in early diagnosis of NSCLC. Method： A total of 68 NSCLC patients admitted to our hospital were selected as the case group， and 68 normal people who underwent physical examination in our hospital during the same period were selected as the control group. Real-time fluorescence quantitative PCR （RT-QPCR） was used to detect the expression of circPVT1 in lung cancer tissues and adjacent normal tissues as well as the serum of the two groups， the expression level of circPVT1 and its relationship with the clinicopathological features of NSCLC were analyzed， the application value of circPVT1 for the early diagnosis of NSCLC was analyzed by ROC curve. Result： The expression level of circPVT1 in lung cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues （P<0.05）. The serum circPVT1 expression level in case group was higher than that in control group （P<0.05）. There was no significant difference in the expression level of circPVT1 in lung cancer tissues of different genders， ages， pathological types， tumor sizes and histological differentiation degrees （P>0.05）， but there were statistically significant differences in circPVT1 expression levels in lung cancer tissues with or without smoking， different tumor stages and with or without lymph node metastasis （P<0.05）. The area under ROC curve for diagnosis of tissue circPVT1 expression level in NSCLC was 0.805 [P<0.001， 95%CI （0.731， 0.880）]. The area under ROC curve of serum circPVT1 expression level for diagnosis of NSCLC was 0.782 [P<0.001， 95%CI （0.704， 0.860）]. Conclusion： The expression level of circPVT1 in NSCLC tissues and serum was significantly increased， the high expression of circPVT1 is associated with smoking， tumor stage and lymph node metastasis， circPVT1 has a certain diagnostic value for NSCLC.

[Key words] NSCLC circPVT1 ROC curve

First-author’s address： School of Public Health of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.31.003

肺癌已成為發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，發(fā)病情況仍處于逐年上升的趨勢，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占比最高，達到80%～90%。肺癌高額的治療費用，給家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)，且很多患者就診時肺癌已經(jīng)發(fā)展到中晚期，失去了治療的最佳時機，目前手術(shù)、放化療、免疫治療、靶向治療等各種方法的應(yīng)用，5年生存率也僅15%左右[1]。因此，早期診斷、及早治療才是提高肺癌治療效果的重要方法[2]。環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs）存在于真核生物細胞質(zhì)中，由于其特殊的廣泛性、保守性、穩(wěn)定性等特征，有望成為腫瘤早期診斷的新的生物標(biāo)記物[3]。circPVT1在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都起著重要作用，但關(guān)于circPVT1在肺癌中的表達情況的報道比較少見。本研究通過分析NSCLC患者組織及血液circPVT1的表達水平及其對于NSCLC的診斷價值，以期為肺癌的早期診療提供有價值的信息，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月-2019年12月于本院就診的NSCLC患者68例作為病例組。納入標(biāo)準：經(jīng)手術(shù)切除肺組織進行病理檢測，確診為NSCLC;本研究前未進行與肺癌相關(guān)的手術(shù)、放化療或生物學(xué)治療。排除標(biāo)準：合并其他惡性腫瘤;臨床資料不全。另選取同期于本院體檢的68例健康者作為對照組。所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2 方法 病例組術(shù)中留取肺癌組織和癌旁正常組織（距病灶2 cm），放于離心管中，液氮凍存。兩組抽取外周靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液存于EP管中，存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用Trizol法提取肺癌組織、癌旁正常組織及血清中總RNA，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR引物由上海生工生物工程公司合成，內(nèi)參GAPDH，以2-ΔΔCt表示目的基因的表達。circPVT1：正向引物CGACTCTTCCTGGTGAAGCATCTGAT;反向引物TACTTGAACGAAGCTCCATGCAGC;內(nèi)參GADPH：正向引物GCACCGTCAAGGCTGAGAAC;反向引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGT。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗;不符合正態(tài)分布的計量資料用M（P25，P75）表示，比較采用秩和檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗;采用ROC曲線分析血清及組織circPVT1表達水平對NSCLC的診斷價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 病例組男41例，女27例;年齡38～81歲，平均（62.14±10.98）歲;吸煙者39例，不吸煙者29例;鱗癌37例，腺癌31例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期45例。對照組男39例，女29例;年齡26～75歲，平均（53.26±13.53）歲;吸煙者40例，不吸煙者28例。兩組性別年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 病例組肺癌組織與癌旁正常組織circPVT1表達水平比較 肺癌組織circPVT1相對表達量為0.176（0.049，0.291）高于癌旁正常組織的0.081（0.022，0.179），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖1。

2.3 兩組血清circPVT1表達水平比較 病例組血清circPVT1相對表達量為0.229（0.145，0.388）高于對照組的0.113（0.035，0.157），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2。

2.4 不同臨床特征的NSCLC患者肺癌組織circPVT1表達水平比較 不同性別、年齡、病理類型、腫瘤大小、組織學(xué)分化程度NSCLC患者肺癌組織circPVT1表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;是否吸煙、不同腫瘤分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者肺癌組織circPVT1表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.5 組織circPVT1表達水平對NSCLC的診斷價值 以癌旁正常組織circPVT1表達水平為對照，對circPVT1表達水平對NSCLC的診斷價值采用ROC曲線分析，曲線下面積（AUC）為0.805[P<0.001，95%CI（0.731，0.880）]，見圖3。

2.6 血清circPVT1表達水平對NSCLC的診斷價值 以對照組血清circPVT1表達水平為對照，對circPVT1表達水平對NSCLC的診斷價值采用ROC曲線分析，AUC為0.782[P<0.001，95%CI（0.704，0.860）]，見圖4。

3 討論

環(huán)狀RNA是單鏈非編碼RNA，以共價閉合的連續(xù)環(huán)為特征。不同于線性RNA，它沒有5’端帽子結(jié)構(gòu)和3’端多聚A尾結(jié)構(gòu)，而是3’和5’端直接聯(lián)結(jié)形成一種閉合環(huán)狀的特殊結(jié)構(gòu)，這使其具備許多獨特生物學(xué)特性及功能[4]。環(huán)狀RNA在生物體內(nèi)廣泛存在，在血漿、外泌體等非組織中出現(xiàn)表達失調(diào)，體現(xiàn)出其無創(chuàng)、高效的早期診斷價值，以及對腫瘤變化實行動態(tài)監(jiān)測等方面應(yīng)用意義[5]，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中都體現(xiàn)出其重要作用，成為目前的研究熱點。circPVT1是PVT1基因初始轉(zhuǎn)錄本中的一個外顯子環(huán)化而形成的一種circRNA，位置處于染色體8q24上，擁有癌癥易感基因位點和兩個內(nèi)含子側(cè)翼（41466bP和35269bP），以及許多Alu重復(fù)序列[6]。circPVT1是與人類衰老相關(guān)的circRNA，通過調(diào)控let-7對靶基因的影響來抑制衰老[7]。其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中也體現(xiàn)出其重要價值，circPVT1在胃癌組織中呈現(xiàn)出高表達，并認為是胃癌預(yù)后獨立的生物標(biāo)志物[8]。circPVT1在乳腺癌組織及患者血清中均呈現(xiàn)高表達，有望成為乳腺癌早期診斷的潛在分子生物標(biāo)志物[9]。

本研究結(jié)果顯示，病例組血清circPVT1表達水平高于對照組（P<0.05），circPVT1在NSCLC組織中表達水平高于癌旁正常組織（P<0.05），且其高表達與吸煙、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），提示circRNAs在肺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色[10]。circRNA作為外泌體中的一類核酸分子，主要充當(dāng)微小RNA（miRNA）海綿，發(fā)揮其在基因表達中的調(diào)控作用。外泌體通過運輸大量的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)來參與細胞間的信息交換，抑制或啟動受體細胞中的各種信號通路，發(fā)揮其在腫瘤轉(zhuǎn)移中作用[11]。外泌體來源的circRNA大量存在于腫瘤患者的血漿中，故對腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥進行調(diào)節(jié)[12]。吸煙是NSCLC中基因突變的危險因素，可能與煙草作為致癌物導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量DNA加合物，進而造成呼吸道的細胞損傷有關(guān)。但很多研究更傾向于不吸煙人群，NSCLC中總體基因突變率與吸煙之間的關(guān)聯(lián)[13]。對于研究結(jié)論的不一致，可能與本研究樣本含量不大，且只是進行單一的基因檢測有關(guān)，有待于進一步深入研究。

肺癌患者的診斷目前主要依賴CT影像學(xué)篩查、細胞穿刺活檢、病理組織切片等方法，細胞學(xué)、組織學(xué)診斷雖然有較高的特異性，但敏感性較低。腫瘤生物標(biāo)志物是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，由腫瘤細胞合成、釋放或宿主對腫瘤反應(yīng)性釋放的物質(zhì)[14]，現(xiàn)在已逐步應(yīng)用到腫瘤的早期診斷中，如通過檢測組織或體液中特定circRNAs可以幫助診斷呼吸系統(tǒng)疾病[15-17]。本研究結(jié)果顯示，組織和血清circPVT1診斷NSCLC的ROC曲線下面積分別為0.805和0.782，表明circPVT1對于NSCLC具有較高的診斷能力。很多研究均證實了血漿circRNA對于肺癌的診斷價值，WANG等[18]研究hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821兩種circRNA對肺癌的診斷價值A(chǔ)UC分別為0.921和0.863，ZHAO等[19]研究中hsa_circ_0037515和hsa_circ_0037516兩種circRNA對肺癌的診斷價值A(chǔ)UC分別為0.81和0.82，聯(lián)合后AUC更是提高到0.9，表明血液circPVT1的診斷價值應(yīng)用前景廣闊。尤其是血液circPVT1的測定操作簡單、成本低、侵入性小、更易于被患者所接受，circRNAs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其不容易被核酸酶所分解，保持了高度的穩(wěn)定性，使circPVT1作為NSCLC診斷標(biāo)志物有天然的優(yōu)勢[20]，但尚需更大的樣本量證實及對其作用機制進行更為深入的探索。

綜上所述，circPVT1在NSCLC組織和血清中的表達水平明顯增高，腫瘤組織中circPVT1高表達與吸煙、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，circPVT1對于NSCLC具有一定的診斷價值。在臨床上通過對circPVT1表達的檢測和分析判定，能夠為NSCLC的早期診斷起到輔助性作用，有利于對腫瘤進行早期診斷、監(jiān)測病情和評估預(yù)后。

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（收稿日期：2021-03-01） （本文編輯：田婧）

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