杜李繼，陳瑞瑞，王 凱，陳世金*，陳龍勝*

氣質(zhì)聯(lián)用法研究多花黃精藥材炮制過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化

杜李繼1, 2，陳瑞瑞1, 2，王 凱2，陳世金1, 2*，陳龍勝1, 2*

(1. 安徽省科學(xué)技術(shù)研究院，合肥 230031；2. 安徽省植物活性成分提取分離工程技術(shù)研究中心，合肥 230088)

為比較多花黃精藥材在炮制過程中揮發(fā)油化學(xué)組成及含量變化，探究炮制對(duì)多花黃精藥材揮發(fā)性成分的影響，采用水蒸氣蒸餾法對(duì)不同多花黃精藥材炮制樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)揮發(fā)油化學(xué)組成進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)庫對(duì)比分析多花黃精藥材炮制前后的揮發(fā)性成分變化，并通過主成分分析法進(jìn)行PCA得分分析。結(jié)果表明，揮發(fā)性成分中共鑒定出115種成分，炮制后小分子醛酮類揮發(fā)性物質(zhì)含量明顯降低，9次蒸曬炮制后有機(jī)酸成為主要揮發(fā)性成分，糠醛類等有害物質(zhì)在炮制后含量升高，PCA得分顯示多花黃精炮制過程中揮發(fā)性成分差異顯著?？梢妭鹘y(tǒng)炮制工藝對(duì)黃精的減毒增效有一定的效用，但因毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生，炮制工藝應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化。

多花黃精；炮制；揮發(fā)性成分；氣質(zhì)聯(lián)用

黃精是我國傳統(tǒng)中藥，是百合科植物滇黃精Coll.et Hemsl、黃精Red和多花黃精Hua的干燥根莖[1]。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為生黃精具有一定的刺激性，“久聞氣味，有刺目之感”。對(duì)古代文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在檢索到與黃精相關(guān)的34篇古代文獻(xiàn)中有24篇論及黃精的炮制工藝或效用，涉及九蒸九曬炮制的文獻(xiàn)有19篇[2]，古文獻(xiàn)廣泛認(rèn)為需要通過炮制的過程來消除生黃精“刺人咽喉”的刺激性與毒副作用[3-4]。同時(shí)，炮制過程中其他物質(zhì)的生成與變化也對(duì)黃精炮制產(chǎn)品效用研究提供參考，例如黃精多糖在炮制過程中發(fā)生糖苷鍵的水解和糖的脫水反應(yīng)而生成5-羥甲基糖醛（5-HMF）。5-HMF雖具有防治神經(jīng)退行性疾病等作用，但同時(shí)也存在一定生理毒性[5]。因此，如何做到去除刺激性氣味的同時(shí)控制有害物質(zhì)的生成，對(duì)多花黃精減毒增效、炮制工藝的優(yōu)化提升等具有重要指示作用。作者以揮發(fā)性物質(zhì)研究為切入點(diǎn)，以水蒸氣蒸餾提取法提取蒸曬炮制后多花黃精揮發(fā)性成分[6]，并利用氣質(zhì)聯(lián)用法對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，探究炮制過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化，為炮制工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用的多花黃精藥材采購于安徽池州膳糧黃精坊公司，由安徽省科學(xué)技術(shù)研究院劉玉軍博士鑒定為多花黃精。

5977A-7890B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，MasshunterB07質(zhì)譜軟件工作站(美國安捷倫公司)，天平(德國Sartorius公司)，F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康公司)，組織搗碎機(jī)，揮發(fā)油測(cè)定器(四川蜀牛公司)，水(自制雙蒸水)，色譜純正己烷(德國Merk公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 多花黃精鮮藥材委托安徽池州膳糧黃精坊公司參照傳統(tǒng)九蒸九曬黃精炮制方法加工炮制。黃精樣品洗凈，去須根，整根黃精蒸制，以蒸氣冒出開始計(jì)時(shí)，每次蒸制時(shí)間45 min，氣溫35 ℃以上晴天暴曬8 h，反復(fù)多次蒸曬即分別可得生曬樣品、一蒸一曬、二蒸二曬、三蒸三曬、四蒸四曬、五蒸五曬、六蒸六曬、七蒸七曬、八蒸八曬和九蒸九曬共10種黃精炮制樣品，并依次將其編號(hào)為S0、S1、S2…S9。炮制后的黃精樣品切成厚度1.0 mm 左右薄片，切片以液氮急凍，在急凍狀態(tài)下迅速用組織搗碎機(jī)將切片打碎，破碎時(shí)間20 s，將所得樣品粗粉末立即放入真空干燥機(jī)冷凍干燥，冷凍干燥24 h后繼續(xù)用研磨機(jī)研磨，所得細(xì)粉末過80目篩即得干燥樣品粉末，4 ℃冷藏密封保存。

1.2.2 揮發(fā)油的制備 根據(jù)2015年版中國藥典第四部[1]揮發(fā)油提取方法，準(zhǔn)確稱取樣品粉末20.0 g，轉(zhuǎn)移至燒瓶中，燒瓶中加水300 mL，連接揮發(fā)油測(cè)定器，從測(cè)定器上端加水充滿收集管部分，然后再用移液管加入正己烷3.0 mL，連接冷凝裝置。將燒瓶內(nèi)容物加熱至沸騰，保持沸騰，繼續(xù)蒸餾，其速度以保持冷凝管的中部呈冷卻狀態(tài)為度，蒸餾6 h。蒸餾結(jié)束后取出收集管中上層液體定容，經(jīng)無水硫酸鈉除水后，過0.22 μm有機(jī)濾膜，共得到10個(gè)樣品，冷凍儲(chǔ)藏供GC-MS分析。

1.2.3 GC-MS條件 儀器型號(hào)：安捷倫5977A-7890B軟件：Masshunter B07版；

色譜柱：HP-5MS (30 m × 0.25 mm，0.25 μm) ；

進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣；流速1.0 mL·min-1；

進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比5∶1；進(jìn)樣量1.0 μL；

程序升溫：平衡時(shí)間1 min，起始溫度40 ℃，保持3 min，然后以7 ℃·min-1升至250 ℃并保持3 min；后運(yùn)行：250 ℃保持3 min；

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度250 ℃；離子源：EI源；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：30 ～ 500；溶劑延遲：4.1 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用NIST11 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索，計(jì)算匹配分?jǐn)?shù)大于80分鑒定結(jié)果，并采用峰面積歸一化法計(jì)算樣品中各組分的相對(duì)含量。部分特征性物質(zhì)，以色譜峰面積對(duì)比炮制前后含量的變化。

采用IBM SPSS Statistics 22數(shù)據(jù)分析軟件，以樣品峰面積相對(duì)百分含量為特征值，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 炮制黃精揮發(fā)性成分分析

GC-MS分析10種炮制黃精揮發(fā)性成分的總離子流圖（TCI）見圖1。經(jīng)過NIST11數(shù)據(jù)庫比對(duì)，共鑒定出115種揮發(fā)性物質(zhì)組份（表1）。

圖1 10種炮制黃精樣品揮發(fā)性成分GC-MS分析總離子流圖

Figure 1 TIC of volatile components in 10 samples by GC-MS

通過圖1中10種黃精樣品總離子流色譜圖之間的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，炮制過程使樣品中的低沸點(diǎn)揮發(fā)物質(zhì)大幅降低，揮發(fā)性物質(zhì)總量呈先下降后增長的趨勢(shì)，S0樣品總揮發(fā)性物質(zhì)總量最多，S4樣品總揮發(fā)性物質(zhì)總量最少，S9揮發(fā)性物質(zhì)總量僅次于S0，但其鑒定出的種類最少，僅有9種；S2樣品鑒定出的揮發(fā)性成分種類最多，有47種。表1中列出了鑒定出115種揮發(fā)性物質(zhì)，其中醇類11種，醛類32種，酮類12種，酸類7中，酯類7種，呋喃8種，這幾種物質(zhì)在炮制樣品中的分布如圖2所示。S7、S8和S9這3個(gè)樣品的揮發(fā)性物質(zhì)中出現(xiàn)的長鏈烷烴類物質(zhì)，其異構(gòu)體種類繁多，無法準(zhǔn)確定性，未列入表1中。

在表1中醛類物質(zhì)共鑒定出32種， S0中最多，醛類占S0總揮發(fā)性成分60.39%。隨著蒸曬次數(shù)的增加，醛類物質(zhì)含量下降明顯，S9中僅含有4.43%。其中主要醛類物質(zhì)正己醛（圖3）含量急劇減少。在生曬黃精的揮發(fā)性成分中，正己醛是主要揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的34.34%，其同樣也是鮮黃精的揮發(fā)性成分中的主要成分[6]，是鮮黃精刺激性氣味的來源之一。高濃度正己醛蒸氣對(duì)眼睛、粘膜和上呼吸道有一定的刺激性，經(jīng)過一次蒸曬的炮制即可去除大部分的正己醛，刺激性氣味的祛除即是增效減毒的重要一步。而其他的一些揮發(fā)性香味物質(zhì)，如具有豆香、果香、青香香氣的2－正戊基呋喃和常用于香皂及化妝品中具有玫瑰香味的苯乙醛及其衍生物在炮制蒸曬的過程中含量降低明顯。

表1 10種炮制黃精樣品揮發(fā)性鑒定組分

續(xù)表1

圖 2 10種樣品揮發(fā)性成分中種類物質(zhì)相對(duì)含量熱圖

Figure 2 Heat map of relative contents of volatile components in 10 samples

醇類物質(zhì)在黃精的揮發(fā)性成分中種類和含量較少，共鑒定出11種醇類物質(zhì)，S0樣品中檢測(cè)出4種，含量較低，僅占3.56%。炮制使得醇類物質(zhì)種類和含量下降明顯，S9中未檢測(cè)出醇類物質(zhì)。酮類物質(zhì)鑒定出12種，含量呈現(xiàn)先上升后減少的趨勢(shì)，S4中酮類物質(zhì)含量最高，達(dá)到7.95%，主要成分為己酮。炮制過程造成醇、醛類物質(zhì)氧化成酸類物質(zhì)，酸類物質(zhì)一共鑒定出7種，棕櫚酸含量最多，特別是在S9樣品中，相對(duì)含量達(dá)到44.78%，經(jīng)過9次蒸曬炮制其含量提升幅度巨大（圖3）。

黃精含糖量較高，在高溫蒸制過程中會(huì)發(fā)生糖的熱降解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)，這兩種反應(yīng)均會(huì)產(chǎn)生5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛是中藥材炮制過程中指標(biāo)性副產(chǎn)物，有一定毒性副作用，5-羥甲基糠醛繼續(xù)受熱會(huì)分解產(chǎn)生5-甲基糠醛和糠醛[7]。有研究表明5-羥甲基糠醛含量隨著多花黃精的炮制過程顯著升高[8-9]，而本研究在GC-MS分析中未測(cè)出5-羥甲基糠醛，是由于5-羥甲基糠醛在GC高溫進(jìn)樣口中發(fā)生熱解，但發(fā)現(xiàn)5-甲基糠醛在多花黃精的炮制過程中含量顯著上升，特別是在第9次蒸曬后，5-甲基糠醛含量的大幅提高，同時(shí)糠醛的含量也在炮制過程中快速升高(圖4)?？啡┯址Q2-呋喃甲醛，屬中等毒性類物質(zhì)，其蒸汽具有強(qiáng)烈的刺激性，并有麻醉作用?？啡╊愇镔|(zhì)在體內(nèi)不斷積累會(huì)引起中毒，曾有過因連續(xù)食用某種龜苓膏引起胸口痛、嘔吐、抽筋等癥狀[10]。5-甲基糠醛和糠醛含量的升高是由5-羥基甲基糠醛在大量產(chǎn)生后大量分解產(chǎn)生，這一結(jié)果也與5-羥基甲基糠在炮制過程中含量變化的研究結(jié)果相吻合[8]。因此，糠醛類毒副作用物質(zhì)含量變化，對(duì)炮制工藝的優(yōu)化“減毒增效”有著重要的參考價(jià)值。

圖3 炮制過程中正己醛與棕櫚酸含量變化

Figure 3 Changes of hexanal and palmitic acid contents during the processing

圖4 炮制過程中糠醛和5-甲基糠醛的變化

Figure 4 Changes of furfural and 5-methylfurfural during the processing

此外，值得注意的是吲哚啉的出現(xiàn)。吲哚啉是一類非常重要的雜環(huán)骨架，其衍生物具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、肝臟保護(hù)、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等多種藥理作用[11]。在多次的蒸曬之后，吲哚啉出現(xiàn)在揮發(fā)性成分中，S4樣品中含量最高，達(dá)1.9%，但隨著繼續(xù)蒸曬炮制，含量又繼續(xù)下降，S9樣品中則已經(jīng)消失。這說明在炮制過程中可能產(chǎn)生了吲哚啉及其衍生物，但又在后續(xù)的炮制中分解，雖然此類具有重要生理活性物質(zhì)的出現(xiàn)對(duì)黃精及其炮制品藥用價(jià)值的研究提供了新的啟發(fā)與參考，但也意味著過度加工炮制也會(huì)帶來有效成分的大量損失。

2.2 黃精炮制樣品的PCA得分分析

10個(gè)黃精炮制樣品的GC-MS數(shù)據(jù)經(jīng)PCA分析后得分圖（圖5）顯示，炮制過程能顯著影響樣品的PCA得分，10個(gè)樣品的得分隨著炮制次數(shù)的增加呈現(xiàn)出顯著規(guī)律，樣品在圖中分部呈3個(gè)區(qū)域聚集，S0、S1、S2和S3小分子揮發(fā)性物質(zhì)較多，在PC1因素得分較高。S4、S5在PC1和PC2因素的共同影響下得分非常接近。S6、S7、S8和S9在炮制后期受PC2因素影響較大。我們可以依照這種分布規(guī)律將炮制工藝分為炮制前期、炮制中期和炮制后期3個(gè)主要階段，分階段研究炮制工藝，對(duì)炮制工藝的改良優(yōu)化具有指導(dǎo)意義。

圖5 10個(gè)黃精炮制樣品主成分分析得分圖

Figure 5 PCA analysis scores of 10 samples

3 討論

多花黃精具有健脾補(bǔ)腎、潤肺生津等功效，為藥食同源的道地皖藥，安徽省池州、宣城、黃山等地都是多花黃精的獨(dú)特產(chǎn)地和重要產(chǎn)區(qū)，其中九華黃精已成為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品[12]，相關(guān)產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。九蒸九曬作為古法炮制工藝尤受歡迎，但由于多花黃精含糖量高，在長時(shí)間的高溫蒸制下，美拉德反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生烯醇、烯醛、酮等眾多風(fēng)味物質(zhì)，這種獨(dú)特風(fēng)味可能同時(shí)也會(huì)潛藏著糠醛等有害物質(zhì)。

古代文獻(xiàn)對(duì)炮制黃精的記載多為“久服”或 “常服”[2]，長期食用的情況下如何將毒副作用有效控制，如何以最優(yōu)化的炮制工藝在減毒的同時(shí)限制有害物質(zhì)的產(chǎn)生是現(xiàn)代炮制工藝必須面對(duì)的課題。例如，5-羥甲基糠醛是否對(duì)健康存在潛在的危險(xiǎn)有一定爭(zhēng)議。 5-羥甲基糠醛主要來源于有兩種，一是來源于氨基酸和還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，另外還會(huì)由糖的受熱分解產(chǎn)生[13]。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，5-羥甲基糠醛對(duì)人體橫紋肌、內(nèi)臟和神經(jīng)等具有毒副作用，對(duì)眼睛、皮膚、上呼吸道及黏膜有刺激作用，并能與人體蛋白結(jié)合產(chǎn)生蓄積中毒，還可以誘導(dǎo)一定程度的染色體畸變和顯著減緩有絲分裂活動(dòng)[14]。但從劑量的角度而言，5-羥甲基糠醛只有在較高的濃度下才呈弱毒性，若在正常攝入量的范圍內(nèi)并不存在顯著的健康風(fēng)險(xiǎn)。有研究通過各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了5-羥甲基糠醛每天攝入量在 80 ～100 mg·kg-1范圍內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)有健康危害[15]。因此，通過控制炮制過程中蒸制溫度與時(shí)間，優(yōu)化加工工藝，控制此類物質(zhì)的大量生成，在避免大劑量長期食用的情況下，健康風(fēng)險(xiǎn)是可控的。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)九蒸九曬后的多花黃精，作為刺激性氣味來源的醛類物質(zhì)消失，而炮制過中可能出現(xiàn)的吲哚啉類等其他活性物質(zhì)在九蒸九曬樣品里沒有再出現(xiàn)。推測(cè)是否存在著九蒸九曬過度高溫蒸制引起活性物質(zhì)損失的可能，同時(shí)可否通過控制每次蒸制或總蒸制的時(shí)間與溫度來減少糠醛類物質(zhì)產(chǎn)生[16]。因此，結(jié)合PCA主成分分析結(jié)果，以揮發(fā)性或其他標(biāo)志性生物活性成分的含量為參考，開發(fā)出更加優(yōu)化的炮制工藝，值得進(jìn)一步探究。

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Changes of volatile substances in rhizome ofprocessing by GC-MS

DU Liji1, 2, CHEN Ruirui1, 2, WANG Kai2, CHEN Shijin1, 2, CHEN Longsheng1, 2

(1. Anhui Academy Science and Technology, Hefei 230031;2. Anhui Engineering Research Center for Plant Active Component Extraction and Separation, Hefei 230088)

To observe the composition and content changes of volatile oil in rhizome ofprocessing, and evaluate the effect of processing on the volatile components of processed, we extracted the volatile oil with steam distillation from each processed sample, analyzed its chemical composition by GC-MS (gas chromatography- mass spectrometry) and the changes of its volatile component before and after processing by database comparison and principal component analysis. The result showed: 115 components were identified in the volatile oil, the contents of small molecular aldehydes and ketones volatile substances had significantly reduced after processing, and organic acid became the main volatile component after steaming and drying for nine times, while harmful substances such as furfural increased after processing, and indoline active substances also appeared. PCA scoring showed that the volatile components were significantly different during the processing. In conclusion, the traditional processing plays a certain role in reducing toxicity and increasing efficacy of, but the processing technology should be further optimized due to the accumulation of toxic byproduct.

; processing; volatile components; GC-MS

R282.710.2

A

1672-352X (2021)06-1035-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20220106.017

2022-1-6 20:52:15

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20220106.1254.034.html

2020-10-28

安徽省科技重大專項(xiàng)(17030801026)，安徽省2020年度中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)(202007d06020007)，2020年安徽省博士后研究人員科研活動(dòng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(2020A396)和黃山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2018KN-08)共同資助。

共同第一作者:杜李繼，助理研究員。E-mail：leonardo1317@163.com 陳瑞瑞，助理研究員。E-mail：906537150@qq.com

通信作者:陳世金，助理研究員。E-mail：jj.1235812@163.com 陳龍勝，研究員。E-mail：formatsky@tom.com