易佳，何匯，李博，涂珍，唐麗，張聰，劉建兵

湖北省疾病預防控制中心，湖北 武漢 430079

湖北釘螺(Oncomelaniahupensis)是日本血吸蟲的唯一中間宿主，日本血吸蟲毛蚴必須在釘螺體內(nèi)經(jīng)過無性繁殖才能發(fā)育為感染人、畜的尾蚴[1]。因此，釘螺在日本血吸蟲病的傳播與流行中起著關(guān)鍵作用[2-3]，而控制和消滅釘螺是防控血吸蟲病的重要措施[4-6]。為了更好實現(xiàn)防控血吸蟲病的目標，開展釘螺的生活史研究(包括血吸蟲毛蚴感染階段)就顯得尤為重要。眾所周知，包括釘螺在內(nèi)的所有生物體其體內(nèi)的氧化還原平衡是機體正常行使功能的基礎(chǔ)。因此，評估釘螺感染毛蚴后其抗氧化酶體系的變化對全面認識釘螺生活史具有重要意義。生物體內(nèi)的氧化還原平衡主要由超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)等組成的抗氧化酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)。當化學物質(zhì)或機體自身的應激反應激發(fā)細胞產(chǎn)生過多的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)時，SOD、CAT和POD可協(xié)同發(fā)揮作用，清除活性氧自由基，對增強吞噬細胞防御能力和機體免疫功能有重要作用[7]。當抗氧化防御系統(tǒng)遭到破壞時，活性氧自由基不斷積累并攻擊細胞膜的脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生丙二醛(malondialdehyde，MDA)，引起氧化損傷反應[8-9]。

毛蚴感染釘螺后，釘螺體內(nèi)的免疫應答反應將導致螺體內(nèi)產(chǎn)生大量的不穩(wěn)定活性氧自由基，進而可能誘導機體抗氧化酶體系激活以適應高度的氧化脅迫壓力[10]。然而，目前湖北釘螺對日本血吸蟲侵襲感染的氧化應激響應及免疫防御機制仍不清楚。本研究探討了毛蚴入侵對釘螺存活情況和抗氧化酶體系的影響，旨在為釘螺免疫功能的研究提供參考，也為更加全面認識釘螺生活史提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 在春季藥物滅螺前從湖北省陽新縣現(xiàn)場采集肋殼釘螺，室內(nèi)經(jīng)逸蚴法鑒定為陰性后，用爬行法選取活力較強的成螺(7～8個螺旋)用于實驗。采用湖北省血吸蟲病防治研究所實驗室數(shù)次傳代的日本血吸蟲湖北株尾蚴人工感染家兔，45 d后解剖分離兔肝臟，用搗碎法提取新鮮蟲卵，按常規(guī)方法孵化獲得毛蚴。

1.2實驗處理及樣本采集 實驗設置對照組和實驗組，每組各設3個平皿做平行對照。每個平皿中放入500只釘螺，實驗組釘螺毛蚴感染參照文獻[11]，采用釘螺群體感染法，按釘螺與毛蚴數(shù)量比為1∶10的比例量取毛蚴孵化液至平皿中；對照組加入同等體積不含毛蚴的去氯水至平皿中。兩組同樣置于25℃室溫4 h，并蓋上尼龍紗網(wǎng)防止釘螺爬出。4 h后，將對照組和實驗組釘螺分別置于泥缽中飼養(yǎng)，溫度保持在22℃。每3天換水加飼料1次，每天清除其中的死亡釘螺并記錄各組死亡數(shù)量。此外，在感染后的0、6、12、24、48、72 h和1、2、4、6、8、12周從每個泥缽隨機挑取10只活釘螺，迅速置于解剖鏡下進行解剖，快速分離出軟體組織，準確稱取釘螺軟體組織重量，做好標記，置于-80℃保存待用。

1.3酶活性的測定 按釘螺組織與生理鹽水質(zhì)量比為1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿。充分勻漿后，700g離心10 min，取上清液用于蛋白質(zhì)濃度、酶活及MDA含量的測定。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，所有測定步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍法，測定單位為 g/L；SOD活性測定采用WST-1法，SOD活力單位定義為37℃下，每毫克組織蛋白(mg prot)在每毫升反應液中超氧化物歧化酶抑制率達50%時所對應的酶量為1個活力單位(U)；CAT活性測定采用可見光法，CAT活力單位定義為每毫克組織蛋白(mg prot)每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為1個活力單位(U)；POD測定采用比色法，POD活力單位定義為37℃下，每毫克組織蛋白(mg prot)每分鐘催化1 μg底物的酶量為1個活力單位(U)；采用TBA法測定釘螺組織中的MDA含量。

1.4數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)整理后，用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。計算各觀察時間釘螺的死亡率、酶活性及MDA含量(以算術(shù)均數(shù)±標準差表示)，并用χ2檢驗比較釘螺存活情況，用雙因素方差分析及多重比較分析不同時間點兩組間酶活力及MDA含量的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1釘螺感染血吸蟲毛蚴后的死亡情況 自感染結(jié)束第1周起，每周實驗組和對照組均有釘螺死亡，但有血吸蟲感染的實驗組釘螺每周死亡率均高于對照組，且二者之間差異均有統(tǒng)計學意義(表1)。第10周后實驗組釘螺死亡數(shù)增多，至15周時實驗組釘螺累計死亡率為43.60%，對照組累計死亡率為5.93%。

表1 釘螺死亡情況

2.2釘螺感染血吸蟲毛蚴后72 h內(nèi)抗氧化酶活性及丙二醛含量變化 釘螺感染血吸蟲毛蚴后72 h內(nèi)，實驗組和對照組釘螺SOD、CAT、POD活性差異有統(tǒng)計學意義(SOD：F=34.63，P<0.01；CAT：F=23.50，P<0.01；POD：F=8.594，P<0.01)，實驗組釘螺SOD、CAT、POD活性隨時間逐步升高。釘螺感染血吸蟲毛蚴后24、48、72 h，實驗組SOD活性分別為(42.78±5.81)U/mg prot、(46.11±2.91)U/mg prot和(47.91±2.12)U/mg prot，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(圖1a)；感染血吸蟲毛蚴后72 h，實驗組CAT和POD活性分別為(23.15±1.21)U/mg prot和(15.66±1.44)U/mg prot，較對照組相比活性上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(圖1b、圖1c)。

注：與對照組比較，*表示P<0.05；**表示P<0.01。

2.3釘螺感染血吸蟲毛蚴后12周內(nèi)抗氧化酶活性及丙二醛含量變化 釘螺感染血吸蟲毛蚴后12周內(nèi)，實驗組和對照組SOD、CAT、POD活性和MDA含量差異有統(tǒng)計學意義(SOD：F=88.00，P<0.01；CAT：F=68.69，P<0.01；POD：F=49.19，P<0.01；MDA：F=56.1，P<0.01)。與對照組相比，感染血吸蟲毛蚴的釘螺組SOD活性在第1周出現(xiàn)上升，第4周到達峰值，第6周開始下降至對照組水平，隨后趨于穩(wěn)定，第1、2、4周實驗組SOD活性與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(圖2a)。實驗組CAT活性在第1周就達到峰值，隨后開始下降，第4周開始趨近于對照組水平，隨后趨于穩(wěn)定。與對照組相比，第1、2周CAT活性上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(圖2b)。實驗組POD活性在第1周出現(xiàn)上升，第2周到達峰值，第4周下降，隨后趨于穩(wěn)定。與對照組相比，第1、2周POD活性上升，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(圖2c)。實驗組MDA含量隨著時間逐漸上升，自第2周開始，MDA含量均高于對照組，且差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(圖2d)。

注：與對照組比較，*表示P<0.05；**表示P<0.01。

3 討 論

釘螺感染血吸蟲后，會產(chǎn)生幼蟲移行的機械損傷、螺體抗感染的免疫損害、營養(yǎng)物質(zhì)被掠奪的生理代謝紊亂等損害，甚至導致死亡[12]。關(guān)于毛蚴侵入對釘螺生存生長的影響，熊春蓉等[13]發(fā)現(xiàn)釘螺與毛蚴按照數(shù)量1∶20比例室內(nèi)人工群體感染4 h后，60 d釘螺死亡率高達71.1%。田月等[14]用不同宿主源性日本血吸蟲毛蚴單個釘螺感染法感染釘螺，釘螺與毛蚴數(shù)量比為1∶5，感染4 h并室內(nèi)飼養(yǎng)60 d后，釘螺死亡率為13.5%～49.5%，平均死亡率為 26.8%。本研究中，釘螺人工感染血吸蟲毛蚴后，15周(105 d)時累計死亡率為43.60%，與張聰?shù)萚11]室內(nèi)人工感染后110 d釘螺死亡率為43.80%的研究結(jié)果較為接近。對照組釘螺15周時累計死亡率僅為5.93%。以往研究報道感染螺的壽命一般為3～6個月，感染了血吸蟲的釘螺死亡率明顯增高，生存時間顯著縮短[15]。

釘螺通常能夠通過抗菌肽、凝集素、溶菌酶、酚氧化酶等體液免疫方式攻擊入侵的寄生蟲[16-18]。除體液免疫外，釘螺血淋巴細胞也會通過吞噬、胞飲和細胞毒反應防御入侵的寄生蟲，在此過程中血淋巴細胞會消耗大量的氧，并產(chǎn)生多種活性氧化物。釘螺等需氧生物具有SOD、CAT和 POD等組成的較為完整的抗氧化酶系統(tǒng)，能及時清除活性氧化物，而使自身免于遭受氧化傷害[19-20]。本研究中，感染早期釘螺的抗氧化酶活性升高，SOD活力在24 h、CAT和POD活力在72 h開始與對照組有統(tǒng)計學差異，MDA值72 h內(nèi)無明顯變化，說明毛蚴入侵能夠誘導釘螺啟動抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生抗氧化防御，即為了阻止活性氧帶來的氧化損傷，螺體內(nèi)合成分泌大量SOD、CAT和POD來維持正常的新陳代謝。隨著時間的延長，抗氧化酶活性逐漸降低，SOD活性在感染后第6周、CAT和POD活性在第4周時趨近于對照組水平。而MDA自第2周開始呈現(xiàn)不斷積累趨勢，可能是抗氧化酶系統(tǒng)逐漸遭到破壞，大量活性氧自由基不能及時清除，導致脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)物增多，丙二醛含量增多間接反映了釘螺氧化損傷程度在不斷加劇，這也與感染釘螺死亡情況相一致。自第2周開始，實驗組和對照組釘螺死亡率差異有統(tǒng)計學意義，并且隨時間延長，氧化損傷加劇，實驗組釘螺死亡率逐漸升高。

總之，本研究表明感染早期釘螺能夠通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性來適應毛蚴入侵的脅迫，以清除體內(nèi)積累的活性氧自由基，免受氧化損傷。然而，隨著毛蚴在釘螺體內(nèi)增殖、生長和發(fā)育，釘螺的抗氧化酶體系可能逐漸失效，釘螺組織氧化損傷的程度加劇，導致釘螺出現(xiàn)死亡。本研究有助于加深對血吸蟲與釘螺共存機制的認識，也為釘螺免疫功能的研究提供參考依據(jù)。