白紅燕，馮自力，馮鴻杰，魏鋒，趙麗紅，朱荷琴，顧愛星，張亞林*，彭軍，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/ 棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的維管束系統(tǒng)性病害[1]，嚴重影響作物產(chǎn)量和品質，已成為影響我國棉花綠色發(fā)展的主要障礙[2]。 生物防治因其對環(huán)境污染小，對人畜安全、不易引起抗性等優(yōu)點，成為防控黃萎病的重要手段。 目前，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等可產(chǎn)生耐熱抗逆芽孢的一類細菌成為研究的熱點[3-4]。 Mansoori 等[5]利用4 株芽孢桿菌對棉花種子進行包衣防治黃萎病，結果表明其中2 株芽孢桿菌可以顯著降低發(fā)病率和病情指數(shù)；李社增等[6]研究發(fā)現(xiàn)， 枯草芽孢桿菌NCD-2 對棉花黃萎病的田間防治效果（防效）在70%以上，并且能改善棉花的纖維品質，該菌株已被開發(fā)為防治棉花黃萎病的微生物農(nóng)藥。 然而，枯草芽孢桿菌不同菌株的黃萎病防效參差不齊，有待進一步篩選驗證[7]。

本研究從健康棉花植株及根際土壤中分離獲得枯草芽孢桿菌菌株，采取對峙培養(yǎng)法和對扣培養(yǎng)法篩選具有較高拮抗活性的菌株，并利用溫室試驗驗證其防效及對棉花的促生長作用，為枯草芽孢桿菌防治棉花黃萎病提供支撐，并為下一步開發(fā)生防菌劑產(chǎn)品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

強致病力大麗輪枝菌Vd080，由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所棉花病害研究課題組分離保存。試驗選用耐黃萎病棉花品種魯棉研21 號[8]。

48 株枯草芽孢桿菌： 來自中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所棉花病害研究課題組已建立的棉花生防菌種群資源數(shù)據(jù)庫[9-10]。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、Luria-Bertani（LB）固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1枯草芽孢桿菌的活化。將篩選到的枯草芽孢桿菌在LB 固體培養(yǎng)基上進行活化，選擇單菌落接到LB 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、150 r·min－1搖床培養(yǎng)24 h，獲得枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，備用。大麗輪枝菌菌液制備：取直徑為5 mm 的Vd080 菌餅轉接到察氏培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r·min－1搖床培養(yǎng)7 d，獲得Vd080 孢子懸浮液，備用。

1.2.2對峙培養(yǎng)測定枯草芽孢桿菌對大麗輪枝菌的影響。 在PDA 平板中心接種已經(jīng)活化的直徑為5 mm 的Vd080 菌餅， 然后在距離培養(yǎng)基中心20 mm 處對稱放置2 個牛津杯，每杯內加入50 μL枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液， 以單獨接種Vd080 不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液作為空白對照，每個處理重復5次。 25 ℃恒溫培養(yǎng)觀察抑菌情況，在第10 天，利用十字交叉法測定黃萎病菌菌落直徑，利用下列公式計算抑制率（I）：I＝[（D1－5）－（D2－5）]/ （D1－5）×100%。 式中，D1和D2分別為空白對照和處理菌落直徑（mm）[11]。

1.2.3對扣培養(yǎng)測定枯草芽孢桿菌對V.dahliae 的影響。 在PDA 平板中心接種已經(jīng)活化的直徑為5 mm 的Vd080 菌餅，在LB 固體平板上接種5 μL枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，將2 個平板對扣密封，以單獨接種Vd080 與不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的LB平板對扣培養(yǎng)作為空白對照， 于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，觀察抑菌情況，每個處理重復5 次。利用十字交叉法測定黃萎病菌菌落直徑， 采用1.2.2 中公式計算抑制率。

1.2.4溫室試驗測定枯草芽孢桿菌對棉花黃萎病的防效。 浸種法：將蛭石、沙子、基質按質量比3∶2∶1 混合均勻后裝入紙缽（直徑6 cm，高度10 cm），棉苗培育和病原菌的接種方法參照蛭石沙子無底紙缽定量蘸菌液法[12]。 同時用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液浸泡魯棉研21 號棉種12 h， 每個紙缽中播種8 粒棉種，每6 個紙缽為1 個處理，每個處理重復3 次，以無菌LB 培養(yǎng)基浸種作為對照。 播種后7 d 進行間苗，每缽保留5 株棉苗。 待1 片真葉初現(xiàn)后每紙缽接種10 mL 的Vd080 孢子懸浮液 （孢子含量為1×107mL－1），跟蹤監(jiān)測棉花長勢情況，適時調查棉花黃萎病發(fā)病癥狀。

灌根法：待棉花1 片真葉初現(xiàn)后，用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液灌根，處理后3 d，每紙缽接種10 mL 的Vd080 孢子懸浮液（孢子含量為1×107mL－1），每6個紙缽為1 個處理，每個處理重復3 次，以等量清水灌根為對照。

接種病原菌后15 d 參照5 級分級標準調查發(fā)病情況，同時計算病情指數(shù)和防效[13]。 棉花黃萎病病情指數(shù)參考：DI＝Σ（Ni×i）/（N×4）×100，式中DI為病情指數(shù)，Ni為各級病株數(shù)，i為病級數(shù)值，N為調查總株數(shù)；E（%）＝（DI0－DI1）/DI0×100，式中E為防效，DI0為對照病情指數(shù)，DI1為處理病情指數(shù)。播種后60 d，每個處理隨機選取15 株棉花測量株高、根長、鮮物質質量等生物量指標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和分析采用Microsoft Excel 2019、SPSS 26.0。 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和鄧肯氏多重范圍檢驗進行差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對V.dahliae菌落生長的影響

由表1 可見，對峙培養(yǎng)結果表明，48 株枯草芽孢桿菌中抑制率大于40%的菌株有18 株， 分別是EBS01、EBS02、EBS03、EBS04、EBS05、EBS06、EBS07、EBS08、EBS09、EBS10、BS02、BS04、BS05、BS08、 BS12、 BS16、 BS18 和BS26， 抑 制 率 為40.05%～74.23%，占總數(shù)的37.50%。其中，EBS03、EBS07 和EBS10 菌株處理的大麗輪枝菌Vd080 菌落直徑分別為1.51 cm、1.95 cm 和1.94 cm，抑制率分別為74.23%、63.01%和63.27%。 由圖1 可知，空白對照中Vd080 生長正常， 而在接種枯草芽孢桿菌的處理中，Vd080 生長受到抑制。上述結果表明，EBS03、EBS07 和EBS10 菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對V.dahliae的菌落生長有抑制作用。

圖1 EBS03、EBS07 和EBS10 非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌落生長的影響

表1 對峙培養(yǎng)下不同枯草芽孢桿菌菌株對Vd080 菌落生長抑制情況的比較

2.2 枯草芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對V. dahliae菌落生長的影響

由表2 可知，對扣培養(yǎng)結果表明，48 株枯草芽孢桿菌中抑制率大于25%的菌株有3 株， 分別是EBS03、EBS09 和EBS10， 抑 制 率 在25.27%～64.15%。 如圖2 所示，在空白對照中Vd080 生長正常，培養(yǎng)10 d 后菌落直徑為5.13 cm；而在EBS03、EBS09 和EBS10 菌株處理中，Vd080 菌落生長受到抑制，菌落邊緣呈不規(guī)則鋸齒狀，菌絲生長抑制率分別達到了64.15%、37.37%和25.27%， 表明EBS03、EBS09 和EBS10 菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對棉花黃萎病菌Vd080 的生長有抑制作用。

圖2 EBS03、EBS09 和EBS10 揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對大麗輪枝菌菌落生長的影響

表2 對扣培養(yǎng)下不同枯草芽孢桿菌菌株對Vd080 菌落生長抑制情況的比較

2.3 溫室試驗測定枯草芽孢桿菌對棉花黃萎病的防效

綜合室內對峙、對扣培養(yǎng)試驗結果，選擇抑菌效果較好的18 株枯草芽孢桿菌進行溫室試驗，采用浸種法和灌根法測定其對棉花黃萎病的防效， 最終選擇灌根處理中防效大于55%的菌株。表3 結果表明：浸種處理中，經(jīng)EBS03、EBS07、EBS10 和BS04 菌株處理的棉苗病情指數(shù)分別為8.17、8.18、10.93 和12.85，與對照（34.51）相比分別降低了26.34、26.33、23.58 和21.66，防效在62.77%～76.31% ； 灌 根 處 理 中，EBS03、EBS06、EBS07、EBS10 和BS04 菌株與對照相比顯著降低了棉花黃萎病病情指數(shù)，防效達到57.62%～87.10%。綜上，枯草芽孢桿菌EBS03、EBS07、EBS10 和BS04菌株在2 種處理方法下對黃萎病均具有良好的防效。

表3 枯草芽孢桿菌浸種處理和灌根處理對棉花黃萎病的防治效果

2.4 浸種處理對棉花出苗及生長的影響

浸 種 處 理 的 種 子 中，BS08、BS12、BS16 和BS18 菌株處理的出苗率在80%以上， 高于對照（73.61%），表明以上4 個菌株對棉花出苗有明顯的促進作用；此外，與對照相比，EBS03 和EBS10 菌株處理的棉苗，其株高、地上部鮮物質質量和總鮮物質質量差異顯著， 分別增加了9.94 cm 和9.90 cm、0.85 g 和0.81 g、0.89 g 和0.86 g，增幅為78.08%和77.77%、113.33%和108.00%、107.22%和103.61%（表4）。 表明EBS03 和EBS10 菌株對棉苗的生長發(fā)育有促進作用。

表4 不同浸種處理的棉花出苗及生長指標比較

2.5 灌根處理對棉花生長的影響

EBS02、EBS03、EBS04、EBS05、EBS08 和EBS10菌株灌根處理的棉花根長為7.20～7.73 cm， 顯著高于對照（5.60 cm）。EBS03、EBS07 和EBS10 菌液灌根， 對棉苗地上部鮮物質質量和總鮮物質質量有明顯的促進作用， 分別增加了0.56 g、0.54 g、0.53 g和0.61 g、0.59 g、0.58 g， 增幅分別為69.14%、66.67%、65.43%和69.32%、67.05%、65.91%（表5）， 表 明EBS03、EBS07 和EBS10 菌株可以增加棉苗鮮物質質量。

表5 不同灌根處理下棉花生長指標的比較

3 討論與結論

棉花黃萎病屬于維管束病害， 由于其致病菌（大麗輪枝菌）寄主范圍較廣，并且存在明顯的致病力分化，所以防治難度很大，至今尚未發(fā)現(xiàn)特效的防治藥劑，主要依靠種植抗性品種與生物防治相結合的防治措施[14-16]。芽孢桿菌因具有耐受能力強、繁殖速度快、分布范圍廣等多方面的優(yōu)點，成為防治棉花黃萎病的重要生防菌[17-20]。 陳麗華等[21]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌LH-L3 不但能促進植株的長勢， 還可以抑制棉花黃萎病。大部分直接從植株中分離出的生防菌，可以較好地在植物體內定植。目前，利用芽孢桿菌來防治棉花黃萎病的實例很多，有些已經(jīng)顯現(xiàn)出樂觀的應用效果[20,22]。雖然，枯草芽孢桿菌已廣泛應用于防治棉花黃萎病，但枯草芽孢桿菌存在生防效果不穩(wěn)定、見效慢、貨架期短等問題，這就要求枯草芽孢桿菌不僅要兼?zhèn)渥陨韮?yōu)點，還要兼?zhèn)涓咝傩У膬?yōu)點。

本研究以從健康棉花植株和根際土壤中分離獲得的48 株枯草芽孢桿菌為對象， 通過對峙培養(yǎng)和對扣培養(yǎng)，篩選出18 株對黃萎病菌Vd080 拮抗效果較好的枯草芽孢桿菌，其中EBS03、EBS10 菌株在對峙培養(yǎng)中對黃萎病菌的抑制率分別為74.23%、63.27%，在對扣培養(yǎng)中對黃萎病菌的抑制率分別為64.15%、25.27%。 無論浸種還是灌根處理，EBS03、EBS07、EBS10 和BS04 菌株對棉花黃萎病防效均大于55%。 對18 株枯草芽孢桿菌浸種處理后的棉苗生長發(fā)育進行評估， 發(fā)現(xiàn)EBS03 和EBS10 菌株浸種處理棉苗的株高、地上部鮮物質質量和總鮮物質質量指標表現(xiàn)優(yōu)異，與對照相比分別提高78.08%和77.77%、113.33%和108.00%、107.23%和103.61%。 EBS03 和EBS10 菌株對棉花生長具有促進作用，并具有良好的防病效果。

綜上，枯草芽孢桿菌EBS03 和EBS10 菌株對大麗輪枝菌的生長具有拮抗作用，能有效促進溫室棉苗的生長發(fā)育， 降低黃萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，具有進一步開發(fā)應用的潛力。