毛方明,王紅波,牟同敏

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江西省超級水稻研究發(fā)展中心,江西 南昌 330200;3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所,湖北 武漢 430064)

褐飛虱是水稻上危害性最強(qiáng)的單食性害蟲,具有極強(qiáng)的繁殖能力,主要危害亞洲栽培稻和野生稻。在2006～2015年的10年中,我國每年因稻飛虱造成的水稻產(chǎn)量損失可達(dá)到11.9億kg,占水稻五大病蟲害損失總量的29.51%[1]。褐飛虱的頻繁暴發(fā)不僅對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的影響,還因?yàn)闅⑾x劑的過量使用增加了水稻生產(chǎn)成本,破壞了自然生態(tài)系統(tǒng)平衡。多年實(shí)踐證明,利用褐飛虱抗性基因培育抗褐飛虱水稻新品種,是最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保且符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的褐飛虱防治手段。

到目前為止已至少鑒定到34個主效的褐飛虱抗性基因位點(diǎn)[2-3]。除此之外,還有約100個褐飛虱抗性相關(guān)QTLs被報道。Bph3、Bph6、Bph9、Bph14、BPH18、Bph26、bph29和Bph32等8個抗性基因已經(jīng)被克隆[3-6]。位于第3號染色體長臂端的Bph14基因是首個通過圖位克隆技術(shù)獲得的褐飛虱抗性主效基因[4]。Bph14基因可以使水稻葉鞘中產(chǎn)生大量胼胝質(zhì),保持篩管堵塞,同時還能促進(jìn)胰蛋白酶抑制劑合成來達(dá)到抑制褐飛虱取食的目的[7]。Bph15位于第4號染色體著絲粒臨近區(qū)域的重組冷點(diǎn)區(qū)約580 kb區(qū)間內(nèi),雖然該基因還未被克隆,但實(shí)踐顯示該基因具有較好的抗褐飛虱效果,已被廣泛應(yīng)用于水稻褐飛虱抗性育種中[8]。

利用MAS技術(shù)可快速進(jìn)行優(yōu)良基因滲入及多基因聚合。實(shí)踐證明,利用MAS聚合褐飛虱抗性基因可以有效提高水稻的褐飛虱抗性。Wang等利用MAS將Bph6和Bph9基因聚合于93-11背景中,成功選育出農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)與93-11相似的雙基因聚合系珞揚(yáng)69,其褐飛虱抗性顯著高于Bph6和Bph9的單基因?qū)胂?并且由珞揚(yáng)69組配的攜帶Bph6和Bph9雜合基因的雜交組合也表現(xiàn)出較高的褐飛虱抗性[9]。李進(jìn)波等通過9311和1826水稻品種創(chuàng)建了Bph14和Bph15基因的單基因和雙基因?qū)胂?褐飛虱抗性鑒定顯示其雙基因?qū)胂稻_(dá)到高抗水平,Bph14、Bph15單基因?qū)胂捣謩e表現(xiàn)出中抗以上和抗或高抗水平,說明雙基因的效果強(qiáng)于單基因[10]。

本研究分別以常規(guī)秈稻‘黃華占’和‘五山絲苗’為母本,與攜帶褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的供體材料‘HB13001-14-5’(簡稱HB1-14-5)進(jìn)行雜交和連續(xù)回交,結(jié)合分子標(biāo)記檢測技術(shù)和田間表型選擇,最終選育出2個褐飛虱抗性明顯提高、其他性狀綜合表現(xiàn)與輪回親本‘黃華占’相似的新株系‘HB6-8’和‘HB7-40’,以及2個褐飛虱抗性明顯提高、其他性狀綜合表現(xiàn)與‘五山絲苗’相似的新株系‘HB1-44’和‘HB7-50’。

1 材料與方法

1.1 供試材料和分子標(biāo)記

受體親本‘黃華占’和‘五山絲苗’是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)常規(guī)水稻新品種。本研究的‘黃華占’和‘五山絲苗’種子分別由湖北省種子集團(tuán)有限公司和安徽荃銀種業(yè)有限公司提供。供體親本‘HB1-14-5’是本實(shí)驗(yàn)室從‘新6134/B5’后代選育的攜帶Bph14和Bph15基因的中間材料,抗褐飛虱。

本研究用于檢測Bph14基因的緊密連鎖的Indel標(biāo)記為76-2,正反序列分別為5’-CTGCTGCTGCTCTCGTATTG-3’和5’-CAGGGAAGCTCCAAGAACAG-3’[4]。用于檢測Bph15基因的Indel標(biāo)記為InD4,正反序列分別為5’-AGAATGCTAAAGATGACTGAA-3’和5’-AACGGTATTGTTCTTGTCTAA-3’[8]。DNA的提取參照CTAB微量法；PCR擴(kuò)增程序參考Du等的分子檢測實(shí)驗(yàn)方法[4]。

1.2 苗期褐飛虱抗性的鑒定方法

本試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)褐飛虱鑒定網(wǎng)室進(jìn)行。每個待鑒定的材料各3次重復(fù),B5和TN1分別作為抗蟲對照和感蟲對照。具體操作方法和評價標(biāo)準(zhǔn)參考國際標(biāo)準(zhǔn)苗期集團(tuán)篩選法[11]。

1.3 產(chǎn)量、主要性狀和稻米品質(zhì)的測定方法

于2018年夏季,在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄂州水稻育種基地進(jìn)行產(chǎn)量比較試驗(yàn),每個材料每個重復(fù)種植200株,行距是20 cm，株距是16.7 cm；每個材料3次重復(fù),隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，四周種植保護(hù)行。在移栽后統(tǒng)一進(jìn)行正常的田間管理。在生育期間記載生育期。在成熟時,每小區(qū)取樣5株，進(jìn)行株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等主要性狀的考查。分小區(qū)收獲,在揚(yáng)凈、曬干(含水量13%)后,測定產(chǎn)量。稻米品質(zhì)分析參照徐鵬等的方法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良株系的創(chuàng)建過程

于2014年夏季,在武漢種植受體親本‘黃華占’、‘五山絲苗’和供體親本‘HB1-14-5’,并分別進(jìn)行雜交。在同年冬季,在海南種植2個雜交組合的F1各20株；在苗期，利用與Bph14、Bph15基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對全部單株進(jìn)行分子檢測；在抽穗期,選擇兩個目標(biāo)基因均雜合的單株(即真雜種),分別與對應(yīng)的輪回親本回交,分別收獲BC1F1種子；從BC1F1至BC3F1,每個世代都進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，篩選同時攜帶兩個抗性基因的單株,并選擇表型與輪回親本最相似的單株與對應(yīng)的輪回親本進(jìn)行回交。于2016年5月,在武漢分別種植具有‘黃華占’和‘五山絲苗’遺傳背景的BC3F1世代,選擇其中同時攜帶雜合Bph14、Bph15基因,表型與對應(yīng)輪回親本最相似的單株,收獲BC3F2種子；在BC3F2世代,從880株的‘黃華占’/‘HB1-14-5’群體中篩選獲得攜帶純合Bph14和Bph15基因的單株39個,從720株‘五山絲苗’/‘HB1-14-5’群體中篩選獲得攜帶純合Bph14和Bph15基因的單株28個,分別收獲自交種子;從BC3F3到BC3F5世代,每個世代繼續(xù)利用分子標(biāo)記對目標(biāo)基因進(jìn)行檢測,并跟蹤選擇,同時對中選株系的苗期褐飛虱抗性進(jìn)行鑒定；對BC3F5株系進(jìn)行3次重復(fù)的產(chǎn)量比較試驗(yàn),分析主要性狀及稻米品質(zhì)。在2018年秋季,決選出2個攜帶純合Bph14和Bph15基因,主要性狀及稻米品質(zhì)與‘黃華占’相似的新株系,分別命名為HB6-8和HB7-40;同時決選出2個攜帶純合Bph14和Bph15基因,主要性狀及稻米品質(zhì)與‘五山絲苗’相似的新株系,分別命名為HB1-44和HB7-50。改良株系的創(chuàng)建過程以及新株系抗性基因的分子檢測結(jié)果分別見圖1和圖2。

陰性對照為‘黃華占’和‘五山絲苗’;陽性對照為HB1-14-5;每個株系含5個泳道,76-2和InD4分別檢測Bph14和Bph15基因。

2.2 改良株系的遺傳背景回復(fù)率分析

將4個決選株系的種子進(jìn)行催芽,從中隨機(jī)選取30粒種子的幼芽進(jìn)行混合取樣。樣品送至中國種子集團(tuán)公司生命科學(xué)中心,使用水稻育種芯片RICE6K進(jìn)行遺傳背景分析。RICE6K芯片共包含5102個均勻覆蓋水稻12條染色體的SNP和InDel標(biāo)記,其中SNP的分布密度為每1 Mb 12個SNPs[13]。親本間差異分析結(jié)果表明：在‘黃華占’與‘HB1-14-5’之間有678個SNP標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性；而在‘五山絲苗’與‘HB1-14-5’之間有689個SNP標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性。在改良株系中,來源于供體‘HB1-14-5’的染色體片段主要集中在抗性基因Bph14和Bph15的上下游區(qū)段(圖3)；除此之外,在其余染色體上也有少量供體來源的片段分布；株系HB6-8、HB7-40、HB1-44和HB7-50的遺傳背景回復(fù)率分別為94.52%、90.91%、94.57%和92.69%。

BB表示來源于供體親本的染色體片段;AB表示雜合的染色體片段;AA表示來源于受體親本的染色體片段。

2.3 改良株系在苗期的褐飛虱抗性表現(xiàn)

于2018年7月,在武漢對改良株系的苗期褐飛虱抗性進(jìn)行了鑒定。以TN1作為感蟲對照,以攜帶Bph14和Bph15基因的B5作為抗蟲對照,每份材料3次重復(fù)?？剐澡b定結(jié)果表明：受體親本‘黃華占’和‘五山絲苗’以及感蟲對照TN1的平均受害等級分別為7.0、8.3和8.3級,表現(xiàn)為感或高感褐飛虱；供體親本‘HB1-14-5’和抗蟲對照B5的平均受害等級分別為3.0和1.7級,分別表現(xiàn)為抗和高抗褐飛虱；4個改良株系的平均受害等級為1.0～2.3級,表現(xiàn)為抗或高抗褐飛虱,其中具有‘黃華占’背景的兩個改良株系HB6-8和HB7-40的平均受害等級均為2.3級,表現(xiàn)為抗褐飛虱;具有‘五山絲苗’背景的兩個改良株系HB1-44和HB7-50的平均受害等級分別為1.7和1.0級,均表現(xiàn)為高抗褐飛虱(圖4a和圖4b)。

2.4 改良株系的產(chǎn)量、主要性狀及稻米品質(zhì)表現(xiàn)

改良株系的產(chǎn)量比較試驗(yàn)和主要性狀考察結(jié)果(表1)表明：株系HB6-8和HB7-40的株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗總粒數(shù)、產(chǎn)量與受體親本‘黃華占’沒有顯著差異,但是播始?xì)v期比‘黃華占’縮短了2～3 d,在高溫條件下結(jié)實(shí)率和千粒重比黃華占提高;HB1-44的播始?xì)v期、單株有效穗數(shù)、穗長、結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量都與受體親本‘五山絲苗’沒有顯著差異,但是株高和千粒重顯著提高,每穗總粒數(shù)極顯著降低；株系HB7-50除播始?xì)v期和每穗總粒數(shù)極顯著低于‘五山絲苗’外,產(chǎn)量、其他性狀與五山絲苗無顯著性差異。

稻米品質(zhì)分析結(jié)果(表2)表明,在分析的10項理化指標(biāo)中,改良株系HB6-8和HB7-40與‘黃華占’基本相似，而HB1-44和HB7-50與‘五山絲苗’基本相似。

3 討論

3.1 分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)有助于快速改良水稻的抗性

分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種是目前進(jìn)行作物育種改良的有效途徑,其準(zhǔn)確率和選擇效率高,育種周期短。本研究采用該方法將Bph14 和Bph15基因滲入優(yōu)良常規(guī)稻‘黃華占’和‘五山絲苗’背景中,分別獲得了2個褐飛虱抗性顯著提高,且產(chǎn)量、主要性狀和稻米品質(zhì)與受體親本相似的新株系,可以作為黃華占和五山絲苗的抗褐飛虱替代品系進(jìn)一步進(jìn)行多點(diǎn)試驗(yàn)和區(qū)域試驗(yàn)。

a:褐飛虱取食后幼苗的表現(xiàn)。b:幼苗的抗性分?jǐn)?shù)及抗性水平。B5:抗蟲對照。TN1:感蟲對照。S、HS、R和HR分別表示感、高感、抗和高抗褐飛虱。

表1 改良株系2018年在鄂州的產(chǎn)量和主要性狀表現(xiàn)

表2 改良株系2018年在鄂州的稻米品質(zhì)分析結(jié)果

作物的抗蟲、抗病等抗性基因主要受主效基因的控制,受外界環(huán)境因素的影響較小。通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將這些抗性基因?qū)肽繕?biāo)品種,以改良其抗性是一種十分有效的途徑。例如,任西明等利用Bph14和Bph15基因,通過MAS成功改良了兩系不育系C815S的褐飛虱抗性[14];徐鵬等通過MAS將Pi9、Xa23、Bph14 和Bph15基因聚合于水稻恢復(fù)系R1813中,獲得了稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性均明顯提高的新株系[12]。

利用MAS技術(shù)除了可以進(jìn)行前景(目標(biāo)基因)選擇外,還可以對遺傳背景進(jìn)行選擇。隨著分子標(biāo)記的普及和不斷開發(fā),SSR、RFLP、AFLP、SNP等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)科研的各個領(lǐng)域。前期利用分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景選擇時,可以快速淘汰一些不符合育種要求的單株；對于背景回復(fù)率高的單株,則需要繼續(xù)在未恢復(fù)為輪回親本的位點(diǎn)附近繼續(xù)增加標(biāo)記進(jìn)行回交選擇,以此縮小與輪回親本間的差異。MAS雖然能夠給作物育種和改良提供便利,但在應(yīng)用過程中也暴露出一些缺點(diǎn),比如MAS只能從構(gòu)成表型的所有變異中捕獲主效基因帶來的變異,而非主效基因累加的變異被忽視。為了達(dá)到更加精確的育種目標(biāo),可以利用全基因組選擇方法,在基因組水平上對與目標(biāo)性狀相關(guān)的所有QTL進(jìn)行檢測,從而捕獲主效和非主效基因帶來的變異。

3.2 褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的利用價值及策略

Bph14和Bph15基因是目前褐飛虱抗性基因研究中使用較為廣泛的兩個主效基因,前人研究均表明其具有良好的褐飛虱抗性。本研究利用MAS將Bph14和Bph15基因分別聚合在常規(guī)稻‘黃華占’及‘五山絲苗’中,獲得的4個新株系的褐飛虱抗性均達(dá)抗級水平以上,表明純合Bph14和Bph15基因聚合能夠達(dá)到抗褐飛虱的效果。Hu等的研究表明，Bph14和Bph15在‘明恢63’背景中表現(xiàn)出較高的褐飛虱抗性,在其所配的雜交組合中,Bph14和Bph15在單基因雜合、單基因純合、雙基因雜合、雙基因純合狀態(tài)下均表現(xiàn)出一定的褐飛虱抗性,且抗性逐漸增強(qiáng)[16]。Wang等的研究結(jié)果表明,攜帶純合Bph14和Bph15的親本或雜交組合在苗期均具有優(yōu)良的褐飛虱抗性,而攜帶雜合Bph14和Bph15基因的雜交組合在苗期均表現(xiàn)為感褐飛虱[17]。上述研究結(jié)果表明純合Bph14和Bph15基因在不同遺傳背景中均能表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性,而雜合Bph14和Bph15基因在不同遺傳背景下其抗性可能有差異,表明Bph14和Bph15基因具有劑量效應(yīng),是不完全顯性表達(dá)的。因此,若利用Bph14和Bph15基因進(jìn)行抗蟲雜交稻選育,最好選擇攜帶相同褐飛虱抗性基因的不育系和恢復(fù)系進(jìn)行配組,使雜交稻攜帶純合的褐飛虱抗性基因,從而達(dá)到最佳的抗褐飛虱效果。