張亞若,童盼盼,梁豐志,吳翠云,3,王江波,3*

(1.塔里木大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300;2.塔里木大學(xué) 南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,新疆 阿拉爾 843300;3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室,新疆 阿拉爾 843300)

棗(ZiziphusjujubeMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZiziphusMill)植物[1]。棗樹是我國第一大干果樹種,具有很強的適應(yīng)性,在平川、山地、丘陵均能種植,在我國的栽培大致分布在北緯23.0°～42.5°與東經(jīng)76°～124°區(qū)間內(nèi),除吉林、黑龍江、西藏、青海外,其他地區(qū)均有栽培[2]。得天獨厚的水土光熱氣候等自然資源,造就了新疆紅棗卓越的品質(zhì),新疆的紅棗產(chǎn)量超過全國的1/4[3],已經(jīng)成為新興棗產(chǎn)區(qū)。新疆紅棗價格最高時達(dá)到50～60元/kg;受紅棗價格暴漲的影響,棗農(nóng)迫切追求產(chǎn)量效益,忽視果品品質(zhì),造成了紅棗產(chǎn)業(yè)的不健康發(fā)展[4]。優(yōu)化果實糖酸比、提升品質(zhì)是提高紅棗生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因素,也成為近年來學(xué)者們關(guān)注的重點。在果實發(fā)育過程中,糖含量和糖代謝相關(guān)酶活性的變化特點及相互間的關(guān)系已較為明確[5-9]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,國內(nèi)外有關(guān)蘋果、梨[11-12]、桃[13]、柑橘[14]的分子生物學(xué)研究已十分廣泛,例如：楊靜靜[10]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化‘嘎啦’蘋果,經(jīng)分子和酶活性鑒定,獲得了3個MdFRK2基因過表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因植株;李馨玥等[12]分析了不同基因在‘南果梨’果實發(fā)育過程中的表達(dá)變化,以及在蔗糖轉(zhuǎn)運以及糖的積累和代謝過程中的功能;張春華等[13]利用熒光定量PCR測定了6個蔗糖合成酶基因的表達(dá)水平,結(jié)果表明PpSus3在果實和韌皮部，以及PpSus1在葉片中對糖類代謝可能具有更重要的作用。然而在棗上的研究始終落后于其他大宗果樹。我們選取新疆南疆地區(qū)的主栽紅棗品種為試驗材料,通過高效液相色譜法和實時熒光定量PCR法對棗果實發(fā)育過程中糖組分含量的變化以及糖代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)趨勢進(jìn)行了研究,以期從分子生物學(xué)角度明確棗果實的糖代謝及其調(diào)控機理,為今后棗樹的分子育種和遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

供試紅棗材料采自塔里木大學(xué)棗種植資源圃,該資源圃地處北緯40°32′、東經(jīng)81°17′,屬暖溫帶大陸干旱荒漠氣候區(qū),年均氣溫≥10 ℃,年積溫為4113 ℃·d,無霜期220 d,年均日照時數(shù)2900 h,年均降水量為40.1～82.5 mm;土壤為輕鹽化土。

1.2 供試材料

試驗材料選自資源圃保存的駿棗、灰棗與冬棗品種(圖1)。選擇樹體生長水平良好、樹勢一致的單株各3株作為樣本樹。自棗果實發(fā)育膨大期(8月13日)至完熟期(10月2日),每隔10 d,采取果實樣本1次。采果時從每株樹的不同方向選取大小一致的30個棗果,放入采樣盒中，立即帶回實驗室,洗凈后去核切碎,同時分成兩等份,經(jīng)液氮速凍后,放于-80 ℃冰箱中保存,分別用于糖組分含量、相關(guān)基因表達(dá)的測定。

圖1 駿棗、灰棗和冬棗在不同時期的果實

1.3 試驗方法

1.3.1 糖組分含量的測定 采用高效液相色譜法[15]進(jìn)行測定。樣品制備:精確稱取1.0000 g棗樣,充分研磨后加入10 mL的80%乙醇混勻,于80 ℃水浴加熱30 min,待冷涼至室溫后以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min；然后取上清液,殘渣繼續(xù)用80 ℃的乙醇重復(fù)提??；合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去其中乙醇,用超純水定容至25 mL容量瓶中,過0.45 μm微孔濾膜,待測。高效液相色譜儀1260由美國Agilent公司生產(chǎn)。液相色譜條件:色譜柱Waters XBridgeTM Amide (250 mm×4.6 mm,5 μm)；將溶液A[0.2%三乙胺(TEA)的超純水溶液]和溶液B (0.2%TEA和乙腈)按照24∶76的體積比混合作為流動相；柱溫為30 ℃;霧化管溫度為60 ℃；漂移管溫度為60 ℃；氣流量為1.6 L/min；增益值為1.0。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:將糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水逐級稀釋，配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL等6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液,過0.45 μm微孔濾膜,依次進(jìn)樣10 μL,以糖濃度(X)作為橫坐標(biāo),峰面積(Y)作為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程(表1),相關(guān)系數(shù)為0.9986～0.9997。

表1 糖組分測定的回歸方程及其相關(guān)系數(shù)

1.3.2 Q-PCR分析糖代謝相關(guān)基因的表達(dá) 采用生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)的B518661柱式植物總RNA抽提純化試劑盒,按說明書對駿棗、灰棗和冬棗發(fā)育過程中果實的RNA進(jìn)行提取。使用南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)的R312-01/02試劑盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以UBQ作為內(nèi)參基因[16],表2 為內(nèi)參基因和目的基因的引物序列,由生工生物公司合成特異性引物。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系10 μL：cDNA模板0.5 μL、左右引物各0.2 μL、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 5 μL、ddH2O 4.1 μL。在QuantStudioTM5 System熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析,采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 qRT-PCR的引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Excel 2010和DPS 7.55軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計整理和方差分析；采用QuantStudio Design & Analysis Software軟件對相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗果實發(fā)育過程中糖組分含量的變化

圖2顯示了駿棗、灰棗和冬棗果實在發(fā)育過程中糖組分含量的變化。在這3個主栽品種中,蔗糖含量的變化均表現(xiàn)為前期低、后期高。在8月13日和8月23日,蔗糖含量明顯低于果糖和葡萄糖含量；自9月2日起，蔗糖含量均高于果糖和葡萄糖含量,且隨著果實的成熟而逐漸上升,在每隔10 d的含量之間都存在極顯著性差異,到10月2日時,駿棗、灰棗、冬棗的蔗糖含量分別達(dá)到490.96、507.28、443.06 mg/g。在棗果實的發(fā)育過程中,果糖和葡萄糖的含量始終保持在較為接近的水平,但不同品種的變化趨勢不盡相同。駿棗果實在發(fā)育過程中,果糖和葡萄糖的含量在9月22日最高,分別為102.91和100.29 mg/g。在灰棗中,果糖和葡萄糖的含量在10月2日最高,分別達(dá)到107.28和109.18 mg/g。冬棗中的葡萄糖和果糖含量在9月2日最高,分別為57.80和51.53 mg/g。

2.2 棗果實發(fā)育過程中糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

對棗果實中12個糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測,包括5個蔗糖合成關(guān)鍵基因(ZjSPS1～2、ZjSS1～3)、2個轉(zhuǎn)化酶類基因(ZjvINV1～2)、2個己糖基因(ZjHK3、ZjHK6)、3個糖轉(zhuǎn)運蛋白基因(SUC2～3、SWEET2)。以各品種果實中各基因在8月13日的表達(dá)水平為參照做相對分析。

圖3顯示的是蔗糖合成關(guān)鍵基因(ZjSPS1、ZjSPSP2、ZjSS1、ZjSS2、ZjSS3)在駿棗、灰棗及冬棗的果實發(fā)育過程中表達(dá)量的變化。ZjSPS1和ZjSS2在3個主栽品種果實發(fā)育過程中表達(dá)量的變化趨勢大致相同,都在9月12日最高,之后下降,在10月2日又有所上升。ZjSPSP2、ZjSS1、ZjSS3的表達(dá)量在不同品種中呈現(xiàn)不同的變化趨勢。在駿棗果實的發(fā)育過程中,9月2日ZjSPSP2、ZjSS1、ZjSS3的表達(dá)量極低；9月22日ZjSPSP2的表達(dá)量極低,ZjSS3的表達(dá)量達(dá)到最高；ZjSPSP2和ZjSS1的表達(dá)量在10月2日達(dá)到最高。ZjSS1在灰棗果實發(fā)育過程中的表達(dá)量始終較低,在9月2日最高；ZjSPSP2和ZjSS3在灰棗中的表達(dá)量在9月12日達(dá)到最高,之后逐漸降低。在冬棗中,ZjSPSP2在9月12日的表達(dá)量最高,在10月2日次之;ZjSS1在9月22日的表達(dá)量最高,在8月23日次之;ZjSS3的表達(dá)量始終處在較低水平,以10月2日最低。

圖2 駿棗、灰棗和冬棗果實中糖組分含量的變化

圖3 棗果實發(fā)育過程中ZjSPS1、ZjSPS2、ZjSS1、ZjSS2、ZjSS3基因的表達(dá)量

如圖4所示,轉(zhuǎn)化酶基因(ZjvINV1、ZjvINV2)在3個主栽品種的果實發(fā)育初期(8月13日)表達(dá)量較高,在其他日期的表達(dá)量大都顯著低于8月13日的表達(dá)量,僅駿棗果實中ZjvINV1在9月2日的表達(dá)量略高于8月13日的。己糖激酶基因(ZjHK3、ZjHK6)的表達(dá)量在3個主栽品種果實發(fā)育期間都表現(xiàn)為前期上升,后期下降之后再上升,其中駿棗和冬棗果實中ZjHK3和ZjHK6在不同時期的表達(dá)量差異波動明顯,而灰棗果實中ZjHK3和ZjHK6的表達(dá)量在一個較為接近的水平中變化。

從圖4還可以看出,本試驗檢測的糖轉(zhuǎn)運蛋白基因(ZjSUC2、ZjSUC3、ZjSWEET2)的表達(dá)量在不同品種中呈現(xiàn)出各不相同的變化趨勢。ZjSUC2在駿棗果實中9月22日至10月2日期間表達(dá)量顯著升高,在灰棗果實中9月2日至9月12日期間上升最為明顯,在冬棗果實中8月13日至8月23日期間出現(xiàn)明顯上升,后期大致穩(wěn)定。駿棗和灰棗中ZjSUC3的表達(dá)量均在9月12日最高,在9月22日最低;冬棗中ZjSUC3的表達(dá)量在8月23日最高,在中期趨于穩(wěn)定,在10月2日最低。ZjSWEET2在駿棗整個發(fā)育期間的表達(dá)量都極低,在灰棗和冬棗果實發(fā)育前期的表達(dá)水平低,在9月22日幾乎不表達(dá),但在9月22日至10月2日期間的表達(dá)量上升,在10月2日的表達(dá)量達(dá)到最高。

圖4 棗果實發(fā)育過程中ZjvINV1、ZjvINV2、ZjHK3、ZjHK6、SUC2、SUC3、SWEET2基因的表達(dá)量

2.3 糖組分含量與相關(guān)基因表達(dá)量間的相關(guān)性分析

圖5是3個主栽品種棗果實的糖組分含量與糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)量做相關(guān)性分析的熱圖結(jié)果。果糖含量、葡萄糖含量與ZjSPS1的表達(dá)量呈極顯著正相關(guān),與ZjSS3的表達(dá)量呈顯著正相關(guān),與ZjHK3的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān);果糖含量還與ZjSUC2的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。蔗糖含量與ZjSPS1的表達(dá)量呈顯著正相關(guān),與ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)。

“+”和“-”分別表示正相關(guān)和負(fù)相關(guān)；“*”和“**”分別表示顯著相關(guān)(P<0.05)和極顯著相關(guān)(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

棗果實在發(fā)育時,碳水化合物輸入果實后,僅少量以淀粉的形式積累,大部分以可溶性糖的形式貯存于果實中,是典型的糖積累型果實[17]。根據(jù)成熟時糖組分的比例,可以將糖積累型果實又分為還原糖積累型、中間型、蔗糖積累型3種類型[18]。大多數(shù)研究學(xué)者已明確駿棗、灰棗和冬棗皆屬于蔗糖積累型果實[19-20]。在本試驗中，駿棗、灰棗和冬棗果實在發(fā)育前期以還原糖積累為主,在后期蔗糖含量逐漸上升,還原糖含量略微下降,至果實成熟時,蔗糖含量顯著高于還原糖含量,符合蔗糖積累型果實糖組分含量的變化規(guī)律。糖代謝關(guān)鍵酶主要包括蔗糖合成酶類:蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖合酶(SS),轉(zhuǎn)化酶類(INV)及單糖降解酶類(己糖激酶)[21]。蔣爽等[22]的研究結(jié)果表明,SPS1和SPS2在梨果實糖合成中起關(guān)鍵作用。本試驗結(jié)果表明,在駿棗果實發(fā)育過程中,ZjSPS1和ZjSS2在果實發(fā)育后期呈現(xiàn)特異高表達(dá)趨勢,說明ZjSPS1和ZjSS2在駿棗果實蔗糖積累過程中的調(diào)控作用較強;SWEET2在8月13日之后的表達(dá)水平始終明顯低于8月13日的，這可能是果實中其他糖組分含量低的重要原因。在灰棗中,ZjSPS1自8月23日起的表達(dá)量極顯著高于8月13日的,表明ZjSPS1是灰棗果實蔗糖積累過程中的主要調(diào)控基因;ZjSS2在9月12日時特異高表達(dá),9月12日灰棗果實中的蔗糖含量開始顯著高于還原糖含量,ZjSS2可能在這其中起到關(guān)鍵作用;ZjHK6的表達(dá)量呈前期上升、后期下降的趨勢。張春梅[16]認(rèn)為ZjHK3和ZjHK6可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸-葡萄糖,進(jìn)而分解為磷酸烯醇丙酮酸,為酸代謝提供底物;還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ZjSUC在棗果可溶性糖積累尤其是在蔗糖積累過程中發(fā)揮了重要的作用[23]。本試驗發(fā)現(xiàn)，ZjSUC2在灰棗各時期的表達(dá)量均高于8月13日的,且在其表達(dá)量明顯上升時蔗糖含量也顯著升高,因此推測ZjSUC2在灰棗果實蔗糖積累中起重要作用。在冬棗中,ZjSPS1和ZjSPS2表達(dá)量的變化趨勢基本一致,均為前期低、后期高;ZjSS1在冬棗果實發(fā)育初期的表達(dá)量即出現(xiàn)顯著性上升,而ZjSS2在果實發(fā)育后期出現(xiàn)特異性高表達(dá),說明ZjSPS1、ZjSPS2、ZjSS1和ZjSS2共同調(diào)控冬棗的蔗糖積累過程,且ZjSS2可能具有較強的調(diào)控能力;ZjSWEET2在冬棗成熟期表達(dá)量顯著上升,這可能是成熟期冬棗口感脆甜的主要原因。張春梅[16]對棗和酸棗的研究顯示,ZjvINV1和ZjvINV2在酸棗中的表達(dá)量較高,而在棗中的表達(dá)量極低。本試驗基因表達(dá)分析的結(jié)果顯示,ZjvINV1和ZjvINV2在3個品種的果實發(fā)育期間幾乎不表達(dá),推測ZjvINV1和ZjvINV2在棗果實中的低表達(dá)是果實還原糖含量低于蔗糖含量的重要原因。果實糖組分含量的變化與各基因表達(dá)量變化的相關(guān)性分析結(jié)果表明：在棗果實發(fā)育過程中,ZjSPS1對蔗糖和還原糖的積累都具有一定的調(diào)控作用,與還原糖的積累相關(guān)性更強;ZjSS3和ZjSUC2的表達(dá)促進(jìn)了棗果實中還原糖的積累；ZjHK3的表達(dá)在還原糖的積累中起抑制作用;ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的低表達(dá)在一定程度上促進(jìn)了蔗糖的積累。

綜上所述,本研究得出結(jié)論,在相同的糖積累類型品種中,棗果實糖組分含量在果實發(fā)育過程中的變化規(guī)律大致相同,但不同品種中各基因表達(dá)量的變化趨勢存在一定的差異,其中ZjSPS1和ZjSS2在駿棗果實糖積累過程中起到重要調(diào)控作用;ZjSPS1、ZjSS2、ZjHK6、ZjSUC2在灰棗果實的蔗糖積累中起重要作用;ZjSPS1、ZjSPS2、ZjSS1和ZjSS2共同調(diào)控冬棗的蔗糖積累過程。本研究初步分析了不同基因在駿棗、灰棗及冬棗果實發(fā)育過程中的表達(dá)變化,但不同基因在棗果實蔗糖轉(zhuǎn)運以及糖積累和代謝過程中的具體功能還需進(jìn)一步研究。