郎程菠 楊 耿 吳振興

（杭州醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，浙江 杭州310053）

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人肝腫瘤細胞株HepG-2 來自浙江科學醫(yī)學院；F-12K 培養(yǎng)基選用Procell；DMEM 培養(yǎng)基選用HyClone；FBS 胎牛血清、PBS、DMSO、雙抗、胰酶購自碧云天。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞傳代

待細胞生長至培養(yǎng)皿的80%-90%時進行傳代。棄上清，用1mlPBS 清洗兩次，棄PBS，加1ml 胰酶后放置在培養(yǎng)箱中37℃消化1min，鏡下觀察細胞形態(tài)變圓后棄胰酶，加2ml 培養(yǎng)液用移液槍沖刷并收集細胞。將上述的2ml 混有細胞的培養(yǎng)液向兩個空皿中各加入1ml，再將培養(yǎng)液補足至7ml，輕微振蕩后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞換液

棄上清，用1mlPBS 清洗兩次，棄PBS，將培養(yǎng)液補足至7ml，輕微振蕩后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

圖1

1.3 實驗過程

階段一：

（1）將由DMEM 培養(yǎng)的HepG-2 細胞置于干凈的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（2）每隔48h 給HepG-2 細胞換液；

（3）待HepG-2 生長融合至80%-90%進行傳代，分為兩皿，一皿用7mlDMEM 培養(yǎng)（A），另一皿用2mlDMEM 和5ml F-12K混合培養(yǎng)（B）；

（4）72h 后觀察，完全用DMEM 培養(yǎng)的HepG-2（C）長勢良好形態(tài)正常，DMDM 和F-12K 混合培養(yǎng)的HepG-2（D）未貼壁細胞占多數(shù)，于是對前者進行傳代，仍用7ml DMEM 培養(yǎng)，后者進行換液，用7ml F-12K 培養(yǎng)；

（5）24h 后，傳代下來的兩皿HepG-2（E）都正常貼壁，而經(jīng)過換液的HepG-2（F）基本全部凋亡，于是將用F-12K 培養(yǎng)的HepG-2 收集備用，兩皿正常生長的HepG-2 繼續(xù)培養(yǎng)。

階段二：

（6）48h 后兩皿HepG-2 到了可以傳代的密度，于是進行了傳代，平行傳代成4 皿，其中兩皿繼續(xù)用7ml DMEM 培養(yǎng)，兩皿用7ml F-12K 培養(yǎng)；

（7）48h 后，兩皿DMEM 培養(yǎng)的HepG-2（G）狀態(tài)良好，兩皿F-12K 培養(yǎng)的HepG-2（H）有部分的凋亡；

（8）24h 后，兩皿DMEM 培養(yǎng)的HepG-2 狀態(tài)依舊良好，于是收集凍存，兩皿F-12K 培養(yǎng)的HepG-2 長勢較稀，于是將一皿換液，依舊用7ml F-12K 培養(yǎng)，另一皿換液成7ml DMEM 培養(yǎng)；

（9）24h 后，換過液的F-12K 培養(yǎng)的HepG-2（I）數(shù)量恒定，而改用DMEM 培養(yǎng)的HepG-2（J）有增殖趨勢，長勢更好；

（10）24h 后，F(xiàn)-12K 培養(yǎng)的HepG-2（K）有一定程度的增殖，細胞各方面狀態(tài)都有所提升，DMEM 培養(yǎng)的HepG-2（L）增殖效果顯著，密集程度大于前者，形態(tài)上已經(jīng)不同于最初始培養(yǎng)的HepG-2。

表1

2 實驗結(jié)果

階段一中，72h 后，完全用DMEM 培養(yǎng)的HepG-2 生長良好，幾乎全部貼壁，呈不規(guī)則梭形；而F-12K 和DMEM 混合培養(yǎng)的HepG-2 貼壁情況較差，細胞呈圓形，經(jīng)過24h 后，出現(xiàn)大量疑似凋亡細胞的懸浮顆粒，很難找到貼壁細胞。

階段二中，完全用DMEM 培養(yǎng)的HepG-2 整個過程都長勢好，顆粒飽滿，增殖速度快；完全用F-12K 培養(yǎng)的HepG-2 在培養(yǎng)48h 后，有部分懸浮顆粒疑似凋亡細胞，隨后對兩皿細胞分別用DMEM 和F-12K 換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，兩皿細胞貼壁狀態(tài)都良好，由F-12K 換成DMEM 培養(yǎng)的HepG-2 細胞更密集，長得更滿。兩皿細胞形態(tài)上棱角不分明，偏扁圓形，容易聚集生長，與原始的HepG-2 區(qū)別明顯，猜測可能已經(jīng)有變異。

3 討論

培養(yǎng)基是細胞生長繁殖的重要因素，細胞在體外得以生長增殖需要足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氨基酸[1]，而培養(yǎng)基中各氨基酸及其他營養(yǎng)物質(zhì)的比例對于細胞社會性有不可忽視的影響[2-3]。Valdis Pirsko[4]等人設(shè)計實驗，將三種乳腺癌細胞系（MCF7,SkBr3和MDA-MB-436）分別用三種細胞培養(yǎng)基（Eagle's Minimum Essential Medium,McCoy's 5a 和Leibovitz's L-15）培養(yǎng)四代并通過qPCR 測量癌細胞轉(zhuǎn)錄表達水平，最后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)基的差異在細胞生長的表型上有顯著的影響。從本次實驗結(jié)果來看，原先在DMEM 培養(yǎng)基中快速增殖的HepG-2 細胞，在更換了培養(yǎng)基環(huán)境之后增殖速度明顯下降，并且細胞狀態(tài)不如從前。從表1 中不難看出，DMEM 培養(yǎng)基中葡萄糖、甘氨酸、L-蘇氨酸、L-絲氨酸氨基酸等含量遠高于后者，然而后者的精氨酸鹽酸鹽含量較前者多。如果能證實F-12K 培養(yǎng)基的組分不利于或者能夠抑制HepG-2 細胞的生長，那么臨床上或許可以參考F-12K 培養(yǎng)基的營養(yǎng)比例給肝癌患者擬出類似的營養(yǎng)食譜，控制病情，從飲食上治療，那對于對抗癌癥又是一個新的思路。本次實驗每隔24h 觀察一次，細胞在培養(yǎng)皿中長滿至80%～90%進行傳代，沒有固定的培養(yǎng)時間[5]，目前只是初步地通過鏡下來觀察HepG-2 細胞在DMEM 和F-12K 中的生長狀況，不同培養(yǎng)條件下的HepG-2 細胞均被收集，后期還可以用Western blotting檢測不同培養(yǎng)條件下HepG-2 細胞中凋亡蛋白的表達情況，從分子水平上提供更有力的佐證。