梁秋妍 鄭紅梅 付勁蓉 劉麗娟 張曉波 錢莉玲 周玉峰,2

兒童哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病，嚴(yán)重影響患兒的身心健康，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確[1]。1990至2010年，我國<14歲兒童哮喘的累積患病率上升了2.8倍[2]，這一現(xiàn)象無法用DNA序列的改變來解釋，表觀遺傳學(xué)機(jī)制在其中發(fā)揮了重要作用[3, 4]。表觀遺傳學(xué)是不依賴DNA序列變化、由染色質(zhì)改變產(chǎn)生、可穩(wěn)定遺傳的表型，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等。

環(huán)狀RNA(circRNA) 是一種經(jīng)特殊剪切而產(chǎn)生的共價(jià)閉合環(huán)狀內(nèi)源性非編碼RNA，在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)[5, 6]。環(huán)狀RNAcircHIPK3(hsa_circ_0000284)/circHIPK3(mmu_circ_0001052)是來源于HIPK3基因的一個環(huán)狀RNA[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道[8]，circHIPK3在過敏性鼻炎中上調(diào)，并通過靶向miR-495促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化來影響過敏性鼻炎的鼻部癥狀。因?yàn)門細(xì)胞分化在哮喘的發(fā)病過程中也起著極其重要的作用，因此推測circHIPK3可能在哮喘中也發(fā)揮重要作用，本研究旨在檢測circHIPK3在哮喘患兒和哮喘小鼠模型的表達(dá)，并進(jìn)行相關(guān)性分析研究。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究的實(shí)驗(yàn)方案獲得復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)倫理委員會批準(zhǔn)(復(fù)兒倫審[2016]141號)。本研究獲得哮喘組患兒和對照組兒童家長的口頭知情同意，采血用于本研究檢測。

1.2 哮喘組納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入2017年8月11日至2019年8月5日在我院呼吸科門診診斷為哮喘的患兒，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016版《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[2]。排除合并其他呼吸道疾病(如肺炎)、 心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者。

1.3 對照組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：為我院健康體檢門診的體檢兒童，排除有過敏史及近期呼吸道感染者。

1.4 外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)提取 采用密度梯度離心法，操作參考文獻(xiàn)[9]。

1.5 小鼠哮喘模型的構(gòu)建和肺組織提取 采用6～8周齡SPF級C57BL/6品系雌性小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司)，飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物房，操作遵守實(shí)驗(yàn)動物倫理原則。以PBS處理作為對照，采用蟑螂提取物(CRE)誘導(dǎo)小鼠構(gòu)建哮喘模型，具體步驟參考文獻(xiàn)[10]。

1.6 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和qPCR 采用Trizol法提取RNA，分別用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時定量PCR，步驟同文獻(xiàn)[9]，引物序列見表1。參照Takara的SYBR GREEN試劑說明書的qPCR反應(yīng)二步法進(jìn)行操作。β-actin為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法。

1.7 miRNA靶向性分析 通過circinteractome網(wǎng)站(https://circinteractome.nia.nih.gov/)查找circHIPK3結(jié)合的miRNA，通過pubmed查找miRNA成熟序列和T-bet3'UTR序列，通過RNA22網(wǎng)站(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/) 進(jìn)行相關(guān)序列配對分析。

1.8 GEO 數(shù)據(jù)庫分析 通過搜索篩選，查找兒童哮喘相關(guān)miRNA數(shù)據(jù)庫GSE120172，經(jīng)GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE120172)進(jìn)行分組分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料如符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示。計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊性的兩組資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；不符合正態(tài)分布或方差不齊的，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。對滿足雙變量呈正態(tài)分布的資料用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行直線相關(guān)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 哮喘組43例，均為輕度哮喘，男35例，女8例，中位年齡 6.5(4～10)歲。 外周血平均嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)為(445±327)(正常值60～300)個·μL-1；26例檢測了血清總IgE(IU·mL-1)，<100者10例(38.5%)，～200者7例(26.9%)，>200者9例(34.6%)；33例行肺功能檢查，17例異常(51.5%)。

對照組28例，男22例，女6例，中位年齡 6.4(4～10)歲。

2.2circHIPK3和T-bet在哮喘組和對照組PBMCs中的表達(dá) 圖1A顯示，與對照組相比，circHIPK3在哮喘組PBMCs中低表達(dá) (t=4.627，P<0.001)；圖1B顯示，T細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-bet在哮喘組也呈低表達(dá)(t=2.727,P<0.01)；圖1C顯示，在哮喘患兒中circHIPK3與T-bet呈正相關(guān)(R=0.483 0，P=0.0007)。

2.3circHIPK3和T-bet在哮喘小鼠肺組織中的表達(dá) 圖2A顯示，與PBS處理的對照組小鼠相比，circHIPK3在哮喘小鼠肺組織中呈低表達(dá)(t=6.438，p<0.001)，T-bet表達(dá)也在哮喘組中明顯下降(t=10.280，P<0.001，圖2B)，二者呈正相關(guān)(R=0.897，P<0.001，圖2C)。

圖1 circHIPK3、T-bet在哮喘患兒和健康對照PBMCs中的表達(dá)及其相關(guān)性

圖2 circHIPK3和T-bet在小鼠哮喘模型中的表達(dá)

2.4circHIPK3作用靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析circHIPK3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中[7, 11, 12]，故推測circHIPK3可能在細(xì)胞質(zhì)中作為一種“海綿體”吸附miRNA而影響T-bet的表達(dá)。通過circinteractome網(wǎng)站預(yù)測circHIPK3結(jié)合的miRNA(圖3A)，miRWalk 網(wǎng)站預(yù)測靶向T-bet的miRNA，將兩組數(shù)據(jù)疊加，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-485-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-326與circHIPK3和T-bet均有結(jié)合的可能(圖3B)。

圖3 circHIPK3可通過競爭結(jié)合miR-485-3p影響T-bet

檢索GEO數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在哮喘患兒中hsa-miR-485-3p表達(dá)明顯上調(diào)(圖3C)，且已有文獻(xiàn)報(bào)道circHIPK3可以吸附hsa-miR-485-3p[12]。進(jìn)一步通過生物網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，circHIPK3、hsa-miR-485-3p、T-bet存在堿基互補(bǔ)配對關(guān)系(圖3D)。

2.5circHIPK3與兒童哮喘臨床指標(biāo)的相關(guān)性 圖4顯示，在哮喘患兒中，circHIPK3與外周血EOS呈弱負(fù)相關(guān)，表明circHIPK3可能影響哮喘的炎癥表現(xiàn)。

圖4 外周血嗜酸性粒細(xì)胞與circHIPK3表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

環(huán)狀RNA具有重要的基因調(diào)控功能。近年來，已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道circHIPK3在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7, 12, 13]。Huang等[14]發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA Hsa_circ_0005519通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞中的miRNA hsa-let-7a-5p來影響成人哮喘。目前尚無環(huán)狀RNA在兒童哮喘中的研究報(bào)道。

Zhu等[8]報(bào)道，circHIPK3在過敏性鼻炎中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)節(jié)miR-495來影響Th2細(xì)胞的分化。本研究顯示，circHIPK3在哮喘患兒PBMC中呈現(xiàn)明顯低表達(dá)，且與轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)正相關(guān)；在小鼠哮喘模型肺組織中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。這與circHIPK3在過敏性鼻炎中的表達(dá)情況不同，表明circHIPK3在過敏性鼻炎和哮喘中可能有不同的作用機(jī)制。

文獻(xiàn)報(bào)道，circHIPK3可與miR-485-3p結(jié)合并負(fù)向調(diào)控其表達(dá)[12]。本文通過miRWalk 網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)T-bet是miR-485-3p的靶基因。通過GEO數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在哮喘患者中hsa-miR-485-3p表達(dá)明顯上調(diào)。該結(jié)果與先前文獻(xiàn)報(bào)道[15]一致。本文結(jié)果提示哮喘患兒circHIPK3減少，可能導(dǎo)致了細(xì)胞中游離的miR-485-3p增多，進(jìn)而使T-bet表達(dá)下降，引起Th1/Th2失衡，參與哮喘的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程(圖5)。T-bet轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，而GATA3轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化。在哮喘中，Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子主導(dǎo)形成慢性炎癥，Th1細(xì)胞分化下調(diào)。Th1/Th2細(xì)胞分化失衡在哮喘中具有重要病理生理意義[16]。因此，circHIPK3-hsa-miR-485-3p-T-bet軸的發(fā)現(xiàn)，將可能為哮喘的防治提供新的靶點(diǎn)。

圖5 circHIPK3/miR-485-3p/T-bet在哮喘中的作用模式圖

本研究局限性：研究利用相關(guān)性分析在哮喘患兒和哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNAcircHIPK3與T-bet相關(guān)，但未通過基因功能實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞或者動物水平進(jìn)一步證實(shí)circHIPK3在體內(nèi)外是否具有調(diào)控T-bet以及影響哮喘表型的功能作用；根據(jù)ceRNA理論，利用生物信息技術(shù)結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫的公共數(shù)據(jù)、已發(fā)表文獻(xiàn)輔助驗(yàn)證，分析得出circHIPK3/miR-485-3p/T-bet可能存在的理論，但尚未通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)直接證明。