徐志紅，王秀，劉小燕，劉洋，周萍

在全世界范圍內(nèi)，宮頸癌是發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤之一，其中最為常見的是宮頸鱗癌，其最重要的特征是侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。宮頸持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV)是侵襲性宮頸癌發(fā)生的必要條件[2]。大多數(shù)感染是短暫的并會被機體自發(fā)清除，只有一少部分女性會持續(xù)感染人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)，導致患宮頸癌及癌前病變的風險。然而，HPV檢測陽性與宮頸鱗癌患者預后的關系尚存在爭議。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)/VEGF受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、遷移和侵襲中扮演了重要角色[3]。VEGF-C是旁分泌因子，對正常淋巴管生成至關重要,是宮頸鱗癌潛在的生物標志物[4-5]。VEGF-C與VEGFR-3有望成為宮頸鱗癌潛在的診斷指標。目前HPV16/18與VEGF-C和VEGFR-3在宮頸鱗癌中的相關性研究較少。基于此，本研究將探討正常宮頸樣本、子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepilthelial neoplasias，CIN)I、CIN II、CIN III、宮頸鱗癌中HPV16和HPV18感染的情況以及VEGF-C和VEGFR-3的表達情況，分析宮頸鱗癌中HPV陽性率與VEGF-C和VEGFR-3表達的相關性，以期為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年3月至2019年3月德陽市人民醫(yī)院收治入院且經(jīng)病理診斷的147例宮頸病變患者為研究對象，其中包括CIN I樣本25例、CIN II樣本15例、CIN III樣本32例、宮頸鱗癌樣本75例。另外收集同期體檢的健康女性的正常樣本18例。宮頸病變患者年齡30.76～55.76歲，平均(41.08±4.89)歲；健康女性年齡30.38～55.27歲，平均(38.76±5.01)歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

納入標準：臨床資料完整者；患者知情同意者。排除標準：既往有子宮切除史。為確保本研究的準確性，石蠟病理切片均經(jīng)過兩位以上病理專家審閱。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2 方法

采用原位雜交法對宮頸樣本進行HPV檢測。首先，病理切片經(jīng)烤片脫蠟后，采用微波將放置于雜交增強液中的切片進行加熱修復30 min，將25 μL地高辛標記HPV 16/18探針滴加入每張切片后將玻片蓋好；將溫度設置為95℃，進行變性5 min后，將含有原位雜交增效液的濕盒溫度設置為37℃將其置于內(nèi)，孵化超過16 h；清洗干凈，在濕盒內(nèi)加入50 uL辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)多聚體，孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，采用蘇木素復染，中性樹膠封片。分析HPV 16和HPV 18的感染情況，如果檢測到其中任何一種類型，其結(jié)果為陽性。

樣本中VEGF-C和VEGFR-3的表達均采用免疫組化Envision兩步法分析。首先，在3%的H2O2中放置脫蠟水化后的病理蠟塊進行滅活過氧化物酶，按順序滴入一抗VEGF-C 、VEGFR-3多克隆抗體及二抗-HRP多聚體，DAB，待染色、沖洗后，晾干后封片。對VEGF-C、VEGFR-3的表達進行記錄。VEGFR-3脈管陽性：VEGFR-3區(qū)域通過低倍鏡觀察>5個記為陽性，最終結(jié)果取其平均數(shù)。VEGF-C計數(shù)標準：(-)：無染色或染色細胞<10% ；(+)：染色細胞在11%～30%之間；(++)：染色細胞在31%～50%之間；(+++)：染色細胞 >50%。VEGF-C陽性為細胞胞質(zhì)內(nèi)VEGF-C呈棕黃色沉著。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析。采用單因素方差對多組間對比進行分析，采用最小顯著差法對兩兩比較進行分析，采用Spearman對宮頸鱗癌組織中VEGF-C表達、VEGFR-3脈管陽性與子宮頸CIN的相關性進行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16、HPV18在正常標本及宮頸鱗癌不同病理標本中的感染率

正常宮頸樣本的HPV16、HPV18及HPV16、18雙重感染率與CIN I、CIN II、CIN III及宮頸鱗癌相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CIN I、CIN II、CIN III的HPV16、HPV18及HPV16、18雙重感染率與宮頸鱗癌相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1。

2.2 VEGF-C、VEGFR-3在宮頸鱗癌不同病理標本中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，正常宮頸樣本、CIN I、CIN II和CIN III病理組織中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)均低于宮頸鱗癌組，其中正常宮頸樣本病理組織中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)均低于CIN I、CIN II和CIN III；CIN I病理組織中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)均低于CIN III，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CIN I病理組織中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)與CIN II比較，CIN II病理組織中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)與CIN III比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖1(彩插2)、表2。

2.3 宮頸鱗癌組織中VEGF-C與HPV16/18感染在宮頸鱗癌組織中的表達關系

75例宮頸鱗癌組織中，HPV16/18陽性組VEGF-C陽性表達明顯高于HPV16/18陰性組(χ2=5.703，P=0.017)，詳見表3。

2.4 宮頸組織中VEGF-C表達與VEGFR-3脈管陽性的相關性分析

VEGF-C水平越高則VEGFR-3脈管陽性均數(shù)增高，經(jīng)Spearman相關性分析，VEGF-C表達水平與VEGFR-3脈管陽性均數(shù)呈正相關(P<0.05)，詳見表4。

表1 HPV16、HPV18在宮頸正常及病變標本中的感染率[例(%)]

表2 VEGF-C和VEGFR-3在不同宮頸組織標本中的表達

表3 宮頸鱗癌組織中VEGF-C與HPV16/18感染在宮頸鱗癌組織中的表達關系(例)

表4 宮頸組織中VEGF-C表達與VEGFR-3脈管陽性相關性分析

3 討論

宮頸癌是威脅女性生命健康最主要的惡性腫瘤之一。宮頸癌及癌前病變的主要致病因素是HR-HPV感染，已有相關研究證實，導致人類上皮惡性腫瘤發(fā)生的主要病毒是高危型HPV16/18[6]。HPV16/18致癌主要環(huán)節(jié)是HPV16 E6、E7整合至DNA促使機體內(nèi)大量細胞發(fā)生異常增生、惡化且可改變某些信號通路蛋白表達，導致細胞失衡、宮頸鱗癌發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，正常宮頸樣本的HPV16、HPV18及雙重感染率與CIN I、CIN II、CIN III及宮頸鱗癌相比，差異有統(tǒng)計學意義；而CIN I、CIN II、CIN III的HPV16、HPV18及雙重感染率與宮頸鱗癌相比，差異無統(tǒng)計學意義，說明HR-HPV 感染中的HPV16、HPV18及雙重感染是導致宮頸病變，乃至惡變的重要因素，故在宮頸癌防治時應將預防和篩查HR-HPV感染做為重點工作。

本研究還分析了宮頸鱗癌樣本中VEGF-C的表達和VEGFR-3的脈管陽性情況，旨在探討新的宮頸鱗癌早期診斷和預后評估的策略。VEGF是一類結(jié)構(gòu)上具有同源性并富含半胱氨酸的二聚體糖蛋白，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-D、VEGF-E等。VEGF-A和VEGF-B主要參與血管生成，而VEGF-C和VEGF-D則參與淋巴生成。有研究通過轉(zhuǎn)基因的手段在小鼠中過表達VEGF-C，發(fā)現(xiàn)VEGF-C在腫瘤淋巴管生成過程中發(fā)揮了重要作用[7]。臨床和基礎研究表明，VEGF-C在多種腫瘤性疾病中均有表達，在腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴管生成中發(fā)揮了潛在的作用[8-11]。通常，在胚胎和不同病理條件下，VEGF-C和VEGFR-3共同表達于有淋巴管萌發(fā)的部位。本研究結(jié)果顯示，正常宮頸樣本、CIN I、CIN II和CIN III病理組織中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)均低于宮頸鱗癌組，其中正常宮頸樣本中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)均低于CIN I、CIN II和CIN III，CIN I病理組織中的VEGF-C表達和VEGFR-3脈管陽性均數(shù)均低于CIN III，提示在宮頸鱗癌中VEGF-C表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關。

VEGFR-3作為淋巴特異性的生長因子，是VEGF-C的主要配體[12-13]。Pytowski等[14]發(fā)現(xiàn)，阻斷VEGFR-3可特異性地抑制VEGF-C增強的小鼠淋巴管生成，表明VEGFR-3與VEGF-C作用參與了淋巴的激活。通過與VEGFR-3結(jié)合，VEGF-C能夠誘導VEGFR-3過表達，促使宮頸鱗癌細胞在體外和體內(nèi)的增殖。VEGFR-3主要在淋巴管中表達，與淋巴管內(nèi)皮細胞的遷移、存活和增殖有關，參與淋巴血管生理和病理的過程[15]。其在血管內(nèi)皮細胞中也有表達，參與機體發(fā)育、以及生理的和病理的血管生成[16]。有研究分析了VEGF-C和VEGFR-3在CIN I、CIN II、CIN III和宮頸鱗癌中的表達情況，超過50%的CIN III病變表現(xiàn)為VEGF-C陽性。VEGFR-3在超過50%的CIN III和宮頸癌樣本中發(fā)生表達，而在CIN I和CIN II中的表達率僅占15%，這也說明淋巴轉(zhuǎn)移可能發(fā)生在CIN晚期。本研究結(jié)果顯示，75例宮頸鱗癌組織中，HPV16/18陽性組VEGF-C陽性表達明顯高于HPV16/18陰性組； VEGF-C表達水平與VEGFR-3脈管陽性均數(shù)呈正相關，提示HPV16/18與VEGF-C和VEGFR-3聯(lián)合，有望成為宮頸鱗癌早期診斷和預后評估的指標。然而，HPV16/18與VEGF-C和VEGFR-3表達異常的關系以及之間的相互作用機制，還需要進一步探討。