戴如冰 陳 驊

燒傷是較為常見的外傷性疾病，不僅損害皮膚等熱力直接接觸的組織或器官，還可誘發(fā)全身多組織器官并發(fā)癥，其中急性肺損傷是燒傷早期即出現(xiàn)的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致燒傷患者死亡的主要原因之一[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在燒傷致急性肺損傷的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。芹菜素是一種存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物，以芹菜中含量最高，具有良好的抗氧化、抗炎等生理活性[4-5]。根據(jù)燒傷深度“三度四分法”分級(jí)，臨床上以深Ⅱ度燒傷最為常見[6]。本實(shí)驗(yàn)以深Ⅱ度燒傷模型大鼠為研究對(duì)象，以臨床一線治療用藥地塞米松為陽性對(duì)照藥物，研究芹菜素對(duì)燒傷大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性Wistar 大鼠180只，體質(zhì)量220～250g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號(hào)：SCXK（浙）2017-0010，動(dòng)物合格證號(hào)：202 004013；實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 天，飼養(yǎng)條件設(shè)置：光照黑暗各12h 交替、室溫23～25℃、相對(duì)濕度55%～65%。本實(shí)驗(yàn)通過中國人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批件號(hào)：HJLL[K]字2019-026，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照倫理審批通過的方案執(zhí)行。

1.2 主要藥物與試劑 芹菜素購自陜西慧科植物開發(fā)有限公司（批號(hào)190524，純度≥98%）；地塞米松注射液（規(guī)格：1mL:5mg；批號(hào)1903016）購自山東大陸藥業(yè)有限公司；乳酸鈉林格注射液購自安徽雙鶴藥業(yè)有限公司（批號(hào)20190426）；髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)20191208、2020 0113、20191125、20191218）；腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）。

1.3 主要儀器 YLS-5Q 型燙傷儀（天津科技發(fā)展有限公司）；NF05DH-1831 型血?dú)夥治鰞x（廣州華西科創(chuàng)科技有限公司）；YB-7LF 型組織包埋機(jī)（湖北亞光公司）；CUT 4050 型旋轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica 公司）；CKX41 型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；UV2100 型紫外-可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；Model 680 型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 動(dòng)物分組、模型制備與給藥（1）動(dòng)物分組：將180 只實(shí)驗(yàn)用大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假燒傷組、模型組、地塞米松5mg/kg 組[7]和芹菜素12.5、25、50mg/kg組，各30 只。（2）模型制備[8]：大鼠造模前禁食禁水12h，3mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剃除背毛并使用濃度8%的硫化鈉脫毛，脫毛部位75%乙醇消毒。假燒傷組大鼠腹腔注射5mL 乳酸鈉林格溶液；其余各組大鼠通過燙傷儀（溫度106℃、壓力0.03MPa、持續(xù)時(shí)間5s）制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型，病理切片呈現(xiàn)部分真皮層內(nèi)細(xì)胞壞死、部分毛囊等附件殘存、毛細(xì)血管內(nèi)可見血液淤滯等認(rèn)為造模成功[9]，見圖1-2；造模后立即腹腔注射5mL 乳酸鈉林格溶液。（3）給藥：地塞米松5mg/kg 組腹腔注射5mg/mL 地塞米松溶液，芹菜素12.5、25、50mg/kg 組分別腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 芹菜素溶液（芹菜素加0.9%氯化鈉溶液制備），假燒傷組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；各組注射劑量均為1mL/kg、給藥頻次均為1 天1 次，連續(xù)給藥14 天。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面大體情況

圖2 各組大鼠創(chuàng)面皮膚病理切片（HE 染色×400）

1.5 肺功能指標(biāo)檢測 各組分別隨機(jī)取10 只大鼠，計(jì)數(shù)呼吸頻率；麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈通過抗凝采血管取血，通過血?dú)夥治鰞x檢測血氧分壓（PaO2）值。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并4℃離心（轉(zhuǎn)速3000rpm，時(shí)間10min）后取血漿；經(jīng)脊椎脫臼處死后，開胸取肺組織、結(jié)扎右側(cè)主支氣管，取5mL 4℃預(yù)冷PBS 溶液灌洗左肺并收集灌洗液，4℃離心（轉(zhuǎn)速3000rpm，時(shí)間10min）后取上清液；然后采用溴甲酚氯法分別檢測血漿和肺泡灌洗液中的蛋白含量，肺泡通透指數(shù)=支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量/血漿蛋白含量。

1.6 肺指數(shù)計(jì)算 各組分別隨機(jī)取10 只大鼠，稱量體質(zhì)量；麻醉狀態(tài)下脊椎脫臼處死、開胸取肺組織，生理鹽水沖洗并濾紙拭干后稱量肺質(zhì)量，肺指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.7 肺組織病理學(xué)檢查及損傷評(píng)分 取“1.6”稱重后的肺組織，置4%多聚甲醛溶液中固定72h，石蠟包埋，5μm 厚度連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水洗后行常規(guī)HE 染色（蘇木精溶液染色5min、濃度1%的鹽酸酒精分化3s，0.6%氨水返藍(lán)、伊紅溶液染色1min），然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹脂封片，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察肺組織病理學(xué)變化并照相。參照卜克等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行損傷評(píng)分：通過顯微鏡觀察病理切片，在肺泡水腫、肺泡出血、炎癥細(xì)胞浸潤、肺不張、透明膜形成五個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，正常、輕度、中度、重度分別計(jì)分0、1、2、3 分，總計(jì)15 分。

1.8 肺細(xì)胞凋亡觀察及凋亡指數(shù)（AI）計(jì)算 取“1.7”制備的肺組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗后，按照TUNEL 試劑盒操作步驟進(jìn)行染色處理，然后梯度乙醇脫水、二甲苯透明后50%甘油封片，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡狀況（細(xì)胞核黃色或黃褐色為陽性著色）。AI 計(jì)算：每只大鼠取相同部位切片，每張切片取互不重疊的5 個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)視野中細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，AI（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.9 肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 取1mm×1mm×1mm 肺組織標(biāo)本，依次置于2.5%戊二醛固定6h、1%鋨酸固定1h，梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋、70nm 超薄切片、醋酸鈾浸泡、枸櫞酸鉛染色、沖洗、干燥處理后，通過透射電子顯微鏡觀察肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.10 肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量檢測 取各組剩余的10 只大鼠，麻醉后脊椎脫臼處死，開胸取肺組織、4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，加入適量4℃冷裂解液、研磨勻漿后，4℃、3500rpm 離心10min取上清液，采用比色法檢測MPO 活性、黃嘌呤氧化酶法測定SOD 活性、高錳酸鉀滴定法測定CAT 活性以及硫代巴比妥酸法測定MDA 含量。

1.11 肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量檢測 取“1.10”制備的肺組織勻漿液，4℃、3500rpm 離心10min 取上清液，按照ELISA 試劑盒操作步驟進(jìn)行處理后，通過酶標(biāo)儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠呼吸頻率和肺泡通透指數(shù)升高，PaO2降低（P 均＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg 組呼吸頻率和肺泡通透指數(shù)降低，PaO2升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg 組比較，芹菜素50mg/kg 組大鼠肺泡通透指數(shù)降低更明顯，PaO2升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能的影響（）

表1 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能的影響（）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；PaO2為氧分壓；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

2.2 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺指數(shù)的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠肺指數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg組肺指數(shù)降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg組比較，芹菜素50mg/kg 組肺指數(shù)降低更明顯（P＜0.05）。見表2。

表2 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺指數(shù)、損傷評(píng)分和AI 的影響（）

表2 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺指數(shù)、損傷評(píng)分和AI 的影響（）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；AI 為凋亡指數(shù)；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

2.3 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織病理學(xué)改變的影響 假燒傷組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、肺間質(zhì)較薄、肺泡連接緊密、未見出血和炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺組織呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)模糊、肺間質(zhì)水腫增厚、大量炎性細(xì)胞浸潤、肺泡內(nèi)可見紅細(xì)胞滲出等病理性改變；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素各劑量組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變不同程度好轉(zhuǎn)；其中芹菜素50mg/kg 組肺結(jié)構(gòu)較為清晰、肺間質(zhì)增厚和炎性細(xì)胞浸潤不明顯，效果優(yōu)于其他組（見圖3）。損傷評(píng)分：與假燒傷組比較，模型組大鼠損傷評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg 組損傷評(píng)分降低（P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg組比較，芹菜素50mg/kg 組損傷評(píng)分降低更明顯（P＜0.01）。見表2。

2.4 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺細(xì)胞凋亡的影響假燒傷組大鼠肺組織僅可見極少量的凋亡細(xì)胞；與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，AI 升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg 組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量減少、AI 降低（P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg組比較，芹菜素50mg/kg 組AI 降低更明顯（P＜0.01）。見圖4 和表2。

2.5 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響 假燒傷組大鼠肺泡上皮細(xì)胞胞膜和核膜邊界清晰、結(jié)構(gòu)完整，胞核周圍存在少量板層小體；模型組呈現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、邊界不清，核膜、核仁邊界不清，胞核周圍板層小體數(shù)量明顯增多等超微結(jié)構(gòu)改變；與模型組比較，地塞米松5mg/kg組和芹菜素各劑量組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變呈不同程度好轉(zhuǎn)，其中芹菜素50mg/kg 組改善效果優(yōu)于其他組。見圖5。

圖3 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織病理的影響（HE 染色×200）

圖4 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL ×200 倍）

2.6 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性降低且MDA含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg組SOD 活性升高、MDA 含量降低（P＜0.05），芹菜素25、50mg/kg 組MPO、SOD、CAT 活性升高且MDA 含量降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg 組比較，芹菜素50mg/kg 組MPO、SOD 活性升高且MDA 含量降低更明顯（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

2.7 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的影響 與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，地塞米松5mg/kg 組和芹菜素25、50mg/kg組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量降低（P＜0.01）；與地塞米松5mg/kg 組比較，芹菜素50mg/kg 組TNF-α 含量降低更明顯（P＜0.01）。見表4。

圖5 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變的影響（透射電子顯微鏡×10000）

表3 菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響（）

表3 菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響（）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；MPO 為髓過氧化物酶；SOD 為超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化物酶；MDA 為丙二醛；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

表4 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響（pg/mL，）

表4 芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影響（pg/mL，）

注：假燒傷組和模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1mL/kg；地塞米松5mg/kg 組予腹腔注射濃度5mg/mL 地塞米松溶液1mL/kg；芹菜素12.5、25、50mg/kg 組予腹腔注射濃度12.5、25、50mg/mL 的芹菜素溶液1mL/kg；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白細(xì)胞介素-1β；IL-6 為白細(xì)胞介素-6；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與地塞米松5mg/kg 組比較，cP＜0.01

3 討論

急性肺損傷是燒傷最常見并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致中重度燒傷患者死亡的重要原因。研究表明，除吸入性損傷外，燒傷所致血管活性物質(zhì)（前列腺素、組胺等）、炎癥細(xì)胞因子、氧自由基（ROS）等大量生成與釋放，進(jìn)而引發(fā)肺血管通透性增加與肺組織水腫以及炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷，是燒傷后并發(fā)急性肺損傷的重要機(jī)制[1-3]。

深Ⅱ度燒傷傷及真皮網(wǎng)層，但燒傷創(chuàng)面仍有部分毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附件殘存，若處理不當(dāng)則可能導(dǎo)致創(chuàng)面加深而轉(zhuǎn)變成Ⅲ度燒傷，從而增加治療難度并影響預(yù)后[11]。所以，深Ⅱ度燒傷治療結(jié)局具有較大的可變性，也是燒傷相關(guān)研究的熱點(diǎn)。芹菜素是自然界中廣泛存在的一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物活性；既往研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素能夠通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)內(nèi)毒素和百草枯所致急性肺損傷起到保護(hù)作用[12-13]。本研究采用溫度106℃、壓力0.03MPa 持續(xù)5s 的方法制備深Ⅱ度燒傷模型大鼠，經(jīng)芹菜素治療14 天能夠明顯改善深Ⅱ度燒傷大鼠肺功能（降低呼吸頻率和肺泡通透指數(shù)，提高PaO2）、降低肺指數(shù)、抑制細(xì)胞凋亡、改善肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)病變和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病變，并且芹菜素50mg/kg 組上述作用優(yōu)于或相當(dāng)于地塞米松組，提示芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用。

生理狀態(tài)下，ROS 能夠被SOD、CAT 逐步催化還原而維持動(dòng)態(tài)平衡；但燒傷導(dǎo)致ROS 異常大量釋放而過度消耗SOD 和CAT，導(dǎo)致ROS 代謝失衡而過剩是導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[14]；此外，主要存在于中性粒細(xì)胞的MPO 能夠清除ROS 而抑制氧化應(yīng)激損傷[15]。體內(nèi)蓄積的ROS 將攻擊蛋白質(zhì)、染色體以及生物膜等生成具有生物毒性的MDA。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芹菜素治療14 天能夠顯著提高深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織MPO、SOD、CAT 活性并降低MDA 含量，芹菜素50mg/kg 對(duì)MPO、SOD 和MDA 的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于地塞米松組，提示芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織氧化應(yīng)激損傷具有抑制作用。

燒傷導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 大量合成與釋放而引發(fā)機(jī)體組織炎癥反應(yīng)，并且TNFα、IL-1β 做為趨化因子能夠進(jìn)一步促進(jìn)自身及IL-6表達(dá)上調(diào)，從而形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而加重炎癥損傷[16-17]；此外IL-6 能夠刺激ROS 合成與釋放，從而加重氧化應(yīng)激損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)芹菜素治療14 天能夠顯著降低深Ⅱ度燒傷大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量，芹菜素50mg/kg 對(duì)TNF-α 的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于地塞米松組，提示芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠肺組織炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

綜上所述，芹菜素對(duì)深Ⅱ度燒傷模型大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。而芹菜素對(duì)燒傷所致其他臟器損傷是否也具有保護(hù)作用，還有待于進(jìn)一步研究。